量化人類腸道菌種對艱難梭菌長期生長的影響（三）
通過對其他8種人類腸道細菌在高碳水化合物培養(yǎng)基中的單菌培養(yǎng)進行代謝組學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)，在這種環(huán)境中，艱難梭菌與腸道細菌之間的潛在交叉喂養(yǎng)總體上較為稀少。具體來說，其他腸道物種釋放的代謝物中，只有約3%–15%被艱難梭菌單菌培養(yǎng)利用(圖S6G)。在9種腸道細菌中，CS和CH與艱難梭菌的代謝物利用重疊率最高(分別為61%和36%，圖S6E和S6G)，可能在司提克蘭氏反應(yīng)的氨基酸上與艱難梭菌競爭。這種潛在的資源競爭與它們在與艱難梭菌共培養(yǎng)中的滅絕情況一致(圖S1C和S1F)，因為CS和CH的生長速率也低于艱難梭菌(圖S6H–S6J)。
除了交叉喂養(yǎng)，這種共存還可能通過利用非重疊資源來實現(xiàn)。在高碳水化合物培養(yǎng)基中，艱難梭菌消耗的代謝物中有21%是獨特的(圖S6B)，這表明正交生態(tài)位可能使艱難梭菌與某些腸道物種共存。在這些細菌中，艱難梭菌消耗的代謝物種類數(shù)量僅次于CS(圖S6D)，表明艱難梭菌具有靈活而廣泛的代謝生態(tài)位。
發(fā)酵終產(chǎn)物在腸道微生物組的種間相互作用中起重要作用。因此，除了通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)測量的廣泛代謝物組外，我們還量化了艱難梭菌和PV在生長24小時后培養(yǎng)上清液中丁酸、乳酸、乙酸和琥珀酸的濃度(圖2C和2D)。這些發(fā)酵終產(chǎn)物在腸道中可達到高濃度，并影響人類健康。例如，丁酸是一種有益代謝物，是結(jié)腸細胞的主要能量來源，促進腸道穩(wěn)態(tài)，并已被證明可減少小鼠艱難梭菌感染(CDI)的疾病嚴重程度。盡管艱難梭菌和PV都產(chǎn)生乙酸，但PV產(chǎn)生琥珀酸，艱難梭菌則產(chǎn)生丁酸。在共培養(yǎng)中，琥珀酸濃度顯著低于PV單菌培養(yǎng)，而丁酸濃度顯著高于艱難梭菌單菌培養(yǎng)(圖2C)。這表明艱難梭菌將PV釋放的琥珀酸轉(zhuǎn)化為丁酸。從擬桿菌到艱難梭菌的琥珀酸交叉喂養(yǎng)在小鼠中也被觀察到，這表明這種代謝交換在哺乳動物腸道中具有重要意義。此外，艱難梭菌產(chǎn)生乳酸并被PV利用，表明代謝物的雙向交換(圖2C和2D)。總之，這些數(shù)據(jù)表明，PV和艱難梭菌能夠通過多種代謝物的交換進行相互作用。
除了高碳水化合物濃度環(huán)境中資源競爭的增強和代謝物交叉喂養(yǎng)的減少外，PV在單菌培養(yǎng)及與艱難梭菌的共培養(yǎng)中顯著降低了培養(yǎng)基的pH值(圖S7A)。由于研究表明艱難梭菌的生長在低pH條件下會受到負面影響，15 PV引起的培養(yǎng)基酸化可能促進了競爭性排除的動態(tài)。在有限碳水化合物培養(yǎng)基中，未觀察到培養(yǎng)基酸化，這與艱難梭菌和PV在該環(huán)境中的共存相一致(圖2A)。
總體而言，碳水化合物有限的環(huán)境促進了代謝物交叉喂養(yǎng)以及艱難梭菌和PV之間的共存(圖2E)。在高碳水化合物濃度的環(huán)境中，資源競爭可能占主導(dǎo)地位，并導(dǎo)致培養(yǎng)基pH顯著降低。因此，在與PV的共培養(yǎng)中，艱難梭菌的生長受到抑制，最終在約第35–42次傳代后被排除(圖2F)。
在與PV長期共培養(yǎng)后艱難梭菌種群中的關(guān)鍵代謝基因出現(xiàn)單點突變
除了生態(tài)交互外，艱難梭菌與PV的長期共存可能會導(dǎo)致艱難梭菌的進化適應(yīng)，這對人體腸道可能具有重要意義。為識別在有限碳水化合物培養(yǎng)基中長期共培養(yǎng)后CD-PV群體中出現(xiàn)的突變，我們對第35、49和64次傳代(即第186、261和341代)的CD-PV群體進行了全基因組測序(whole-genome sequencing,WGS)。結(jié)果在艱難梭菌群體中檢測到多個非同義單點突變，突變頻率約為14%至97%(圖S8A；表S5)。由于突變和遺傳漂變的隨機性，重復(fù)實驗的群體未顯示完全相同的進化動態(tài)。
檢測到的非同義突變基因的預(yù)測功能與毒力、膜蛋白、ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運蛋白和代謝(如磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphotransferase system,PTS)和Stickland代謝調(diào)控因子)相關(guān)。這些基因中的一些在來自健康個體和感染艱難梭菌疾病(CDI)患者的18株分離株中表現(xiàn)出氨基酸變異(圖S8B)，表明這些序列變異可能對進化適應(yīng)有貢獻。此外，我們還檢測到PV基因組中從第35次到第64次傳代出現(xiàn)的多處突變，突變頻率約為18%至46%(表S5)。
在艱難梭菌群體中的所有突變中，基因206(G533W)和prdR(A341V)在所有測量的傳代中頻率都顯著增加，并在64次傳代后顯示出最高頻率(圖S8A；表S5)。基因206編碼一種PTS糖運輸子單元IIA，這一基因突變出現(xiàn)在CD-PV共培養(yǎng)的所有三次重復(fù)實驗中，并在所有突變中顯示出最高頻率(傳代35約56%，傳代49可達97%)。相比之下，prdR突變只出現(xiàn)在第49次傳代的CD-PV共培養(yǎng)實驗的一次重復(fù)中(約15%)，并在第64次傳代達到約47%。這一現(xiàn)象與基因206在18株自然分離株中氨基酸序列顯示出變異相關(guān)，而prdR的序列高度保守(圖S8B)。因此，prdR的突變可能僅在特定條件下(如基因206突變背景下)發(fā)生。prdR是一個核心代謝調(diào)節(jié)因子，控制丙氨酸和甘氨酸的優(yōu)先利用，通過Stickland反應(yīng)產(chǎn)生能量，這對于艱難梭菌的生長和定植至關(guān)重要。在丙氨酸存在的情況下，prdR激活編碼丙氨酸還原酶的基因的轉(zhuǎn)錄，并負調(diào)節(jié)編碼甘氨酸還原酶的基因。以前的研究表明，prdR的缺失會影響艱難梭菌毒素的產(chǎn)生。
為了進一步表征這些單點突變，我們從CD-PV群體最后一次傳代中分離出一株攜帶基因206和prdR兩處突變的艱難梭菌菌株(圖3A)。WGS驗證了這兩處突變僅出現(xiàn)在所分離的艱難梭菌菌株(演化菌株)中，而未出現(xiàn)在祖先株中的甘油庫存菌株(表S6和S7)。在有限碳水化合物培養(yǎng)基中與PV共培養(yǎng)341代后，演化艱難梭菌菌株趨于接近于等比例，而祖先株的豐度則遠離等比例(基于Mann-Kendall檢驗的顯著趨勢，圖S7B和S7C)。因此，艱難梭菌菌株與PV共存的穩(wěn)定性高于祖先株。
圖3|艱難梭菌獲得了長期與PV共培養(yǎng)過程中，改變其代謝生態(tài)位的進化
(A)艱難梭菌在與PV共培養(yǎng)的限碳環(huán)境中，經(jīng)過341代分離出來。社區(qū)動態(tài)的圖表來自于圖S4F。
(B)祖代和進化代艱難梭菌株的代謝利用量對數(shù)變換的折疊變化熱圖，與空白培養(yǎng)基相比(n=3)。與空白培養(yǎng)基相比顯著高濃度的代謝物顯示在圖中(兩側(cè)t檢驗，方差不齊)。星號表示在代謝物釋放量之間有顯著差異(兩側(cè)t檢驗，p值<0.05)。
(C)全基因組轉(zhuǎn)錄組剖析實驗的示意圖。
(D)進化代艱難梭菌株與祖代株轉(zhuǎn)錄折疊變化的火山圖。每個數(shù)據(jù)點代表一個單獨的基因。虛線表示2倍變化，水平虛線表示由DESeq2的Wald檢驗計算的統(tǒng)計顯著性閾值(貝南明-霍奇伯格多重檢驗校正，BH調(diào)整p值=0.05)。
(E)選定基因在進化代艱難梭菌株中高表達和低表達的對數(shù)變換折疊變化。垂直虛線表示2倍變化。
(F)當在不同脯氨酸濃度下與PV共培養(yǎng)時，艱難梭菌的豐度。條形圖顯示了12小時時艱難梭菌的豐度(均值±SD，n=3)。兩側(cè)未配對t檢驗p值顯示在圖中。
(G)進化代艱難梭菌株與祖代株在不同葡萄糖和脯氨酸濃度下的適應(yīng)性熱圖。適應(yīng)性比較通過單培養(yǎng)生長下的曲線下面積(AUC)比率量化(圖S11)。星號表示未配對t檢驗之間的顯著性p值。?p<0.05，??p<0.01，???p<0.001。×符號表示未生長。具體p值見圖S11。
(H)進化代艱難梭菌株代謝改變的示意圖。
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