基于革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)曲線等指標(biāo)評(píng)價(jià)纖維素基抑菌材料L-Met改性MCC（M-MCC）抑菌效果（二）
1材料與方法
1.1材料與試劑
L.monocytogenes購(gòu)自美國(guó)農(nóng)業(yè)部食品安全檢驗(yàn)局；S.aureus購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)。
MCC上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司；高碘酸鈉、2，2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2，2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、L-Met、過(guò)硫酸鉀、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（均為分析純）上海麥克林生化科技有限公司；甲醇（色譜純）、二甲基亞砜（分析純）、乙二醇（分析純）廣東光華科技股份有限公司；硼氫化鈉（分析純）江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；無(wú)水乙醇（分析純）無(wú)錫市亞盛化工有限公司；鹽酸（分析純）南京化學(xué)試劑股份有限公司。
1.2儀器與設(shè)備
JJ2000B電子天平常熟雙杰測(cè)試儀器廠；524G恒溫磁力攪拌器上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；DHG-9240A電熱鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司；FE28 pH計(jì)、電導(dǎo)率儀瑞士Mettler Toledo公司；恒溫培養(yǎng)箱寧波江南儀器設(shè)備有限公司；BKQB75L高壓蒸汽滅菌鍋山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；M2E全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀美國(guó)BioTek公司；紫外分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；LL 600300傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀美國(guó)PerkinElmer公司；Sigma 300掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）、LSM900激光共聚焦顯微鏡德國(guó)Zeiss公司。
1.3方法
1.3.1 M-MCC的合成總流程
M-MCC的制備總流程如圖1所示。
圖1 NaIO4氧化法制備M-MCC總流程
1.3.2 MCC的氧化活化
原始的MCC樣品性質(zhì)較為穩(wěn)定，難以直接進(jìn)行接枝。需采用高碘酸鈉氧化法對(duì)MCC進(jìn)行開(kāi)環(huán)氧化，生成雙醛基纖維素（dialdehyde cellulose，DAC），再進(jìn)行下一步的接枝。
MCC氧化成DAC的步驟如下：準(zhǔn)確稱取24.063 g高碘酸鈉（NaIO4），用去離子水溶解，轉(zhuǎn)移到250 mL容量瓶中，超聲30 min使其完全溶解。稱取10 g MCC樣品粉末，置于燒杯中并加入所配的0.37 mol/L NaIO4溶液250 mL，用0.1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值到4左右。用錫紙將燒杯完全包裹以營(yíng)造黑暗條件，以40℃、600 r/min攪拌180 min，隨即加入6 mL乙二醇結(jié)束反應(yīng)，調(diào)節(jié)pH值到8左右再繼續(xù)攪拌30 min，靜置30 min。將所得到的懸浮液倒入3 500 Da的透析袋中透析48 h，期間每8 h將析出溶液更換為去離子水。經(jīng)冷凍干燥后得到氧化的MCC，即DAC。
1.3.3 L-Met的功能化接枝
稱取10 g上述所得DAC，根據(jù)DAC與所用L-Met物質(zhì)的量比為1∶1稱取L-Met，并將二者混合在250 mL去離子水中，在40℃、400 r/min的條件下攪拌混勻5 min后加入5 mL二甲基亞砜，并繼續(xù)攪拌反應(yīng)6 h。然后加入5 g硼氫化鈉（NaBH4），靜置至無(wú)氣泡產(chǎn)生后，加入6 mL無(wú)水乙醇終止反應(yīng)。使用去離子水洗滌所得產(chǎn)物2～3次后，將所得產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至透析袋用去離子水透析48 h，期間每8 h更換去離子水，以除去產(chǎn)物中摻雜的過(guò)量離子。最后冷凍干燥得到最終產(chǎn)物M-MCC。
1.3.4 M-MCC表征分析
1.3.4.1微觀形貌及結(jié)構(gòu)
采用SEM對(duì)改性后的M-MCC表面微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，樣品通過(guò)噴金提高電導(dǎo)率后進(jìn)行測(cè)試，在不同放大倍數(shù)下進(jìn)行拍照。
1.3.4.2表面官能團(tuán)和元素分析
通過(guò)FTIR對(duì)M-MCC進(jìn)行表征，掃描范圍為4 000～400 cm-1，以確定材料的成功合成。通過(guò)能量色散X射線譜（energy dispersive spectrometer，EDS）以及X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）測(cè)試M-MCC中各元素的分布和存在情況。
1.3.4.3 X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）和熱重分析
通過(guò)XRD表征了M-MCC的晶體結(jié)構(gòu)，射線為CuKα，加速電壓為40 kV，加速電流為15 mA，掃描速率2°/min，掃描范圍2θ為5°～90°。
通過(guò)熱重分析儀（thermogravimetric analysis，TGA）表征M-MCC的熱穩(wěn)定性和受熱分解過(guò)程。
1.3.5抑菌性能測(cè)定
1.3.5.1 M-MCC的體外抗氧化活性測(cè)定
將M-MCC加入去離子水中配制成不同質(zhì)量濃度梯度的懸浮液，質(zhì)量濃度梯度設(shè)置為0.1、0.5、1、5、10、20 mg/mL。
使用7 mmol/L的ABTS陽(yáng)離子自由基溶液與過(guò)硫酸鉀溶液在25℃黑暗條件下反應(yīng)12 h，以生成穩(wěn)定的氧化ABTS陽(yáng)離子自由基。用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋ABTS陽(yáng)離子自由基溶液至用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度為0.65～0.75，保存溶液備用。稀釋后的ABTS陽(yáng)離子自由基溶液取200μL與20μL不同濃度梯度的樣品溶液混勻，并在黑暗條件下靜置反應(yīng)10 min后在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的吸光度。同時(shí)以抗壞血酸作為反應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照。ABTS陽(yáng)離子自由基清除率按下式計(jì)算：
式中：A0為空白實(shí)驗(yàn)組的吸光度（以超純水代替樣品）；A1為樣品吸光度；A2為標(biāo)準(zhǔn)組吸光度（以PBS替代稀釋后的ABTS陽(yáng)離子自由基溶液）。
1.3.5.2 M-MCC的MIC和最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）的確定
MIC是指無(wú)法以肉眼觀察到細(xì)菌生長(zhǎng)的抑菌劑最低抑制濃度。MIC和MBC的測(cè)定：將得到的M-MCC以1、5、10、15、20 mg/mL的質(zhì)量濃度梯度溶解于10 mL的無(wú)菌液體培養(yǎng)基中。液體培養(yǎng)基為3 g/100 mL的胰蛋白大豆肉湯。向其中加入100μL濃度為106 CFU/mL的菌懸液，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察菌體生長(zhǎng)情況和培養(yǎng)液渾濁情況，24 h后培養(yǎng)液依然澄清的M-MCC最小濃度即為M-MCC的MIC。取100μL培養(yǎng)液均勻涂布在固體培養(yǎng)基表面，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。沒(méi)有菌落生長(zhǎng)的最小M-MCC濃度即為M-MCC的MBC。
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