生長(zhǎng)曲線測(cè)定法和菌落計(jì)數(shù)法確定YchJ對(duì)鼠傷寒沙門菌抗逆能力的影響——摘要
摘要：目的了解ychJ基因及其編碼蛋白YchJ對(duì)鼠傷寒沙門菌抗逆能力的影響。方法基于ExPASy ProtParam tool和Clustal Omega對(duì)YchJ蛋白性質(zhì)及氨基酸序列保守性等生物信息學(xué)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。采用CRISPRCas9法構(gòu)建鼠傷寒沙門菌ATCC14028s的ychJ基因敲除株△ychJ,并通過(guò)DNA擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行鑒定。分別對(duì)野生株和敲除株進(jìn)行抗逆功能試驗(yàn)，通過(guò)結(jié)晶紫半定量法和剛果紅染色法確定YchJ對(duì)沙門菌生物膜形成的影響；采用生長(zhǎng)曲線測(cè)定法和菌落計(jì)數(shù)法確定YchJ對(duì)沙門菌抗生素耐受能力的影響；利用半固體平板移動(dòng)法檢測(cè)YchJ對(duì)沙門菌運(yùn)動(dòng)能力的影響。結(jié)果YchJ是一種穩(wěn)定的親水性蛋白，其氨基酸序列相對(duì)保守，ychJ基因敲除株構(gòu)建成功。與野生株的RDAR表型（紅色、干燥和粗糙）相比，該敲除株表現(xiàn)為SAW表型（光滑、白色、濕潤(rùn)）。經(jīng)結(jié)晶紫染色后，野生株的A570/A600值為0.8345±0.1016,顯著高于ychJ敲除株的0.2633±0.05051.在抗生素耐受性實(shí)驗(yàn)中，低濃度氨芐青霉素或諾氟沙星壓力下，ychJ敲除株的生存能力顯著降低，僅為野生型的10%-60%.在半固體平板實(shí)驗(yàn)中，ychJ敲除株的擴(kuò)散直徑達(dá)到（5.00±0.10）cm,顯著大于野生株的（1.933±0.1155）cm,表明ychJ敲除株表現(xiàn)出更強(qiáng)的移動(dòng)能力。結(jié)論未知功能蛋白YchJ的缺失會(huì)影響鼠傷寒沙門菌的運(yùn)動(dòng)能力、生物膜形成能力和抗生素耐受能力，為沙門菌及其他胞內(nèi)寄生菌YchJ功能的確定提供理論基礎(chǔ)。
鼠傷寒沙門菌是一種兼性胞內(nèi)寄生的革蘭陰性菌，能通過(guò)污染的水和食物進(jìn)入人體腸道，侵入小腸絨毛上皮細(xì)胞進(jìn)入宿主體內(nèi)，而后被巨噬細(xì)胞吞噬，隨巨噬細(xì)胞擴(kuò)散到淋巴結(jié)、肝臟和脾臟，進(jìn)而引發(fā)全身多器官感染和菌血癥。據(jù)估計(jì)，全球每年有超過(guò)9萬(wàn)人死于與沙門菌感染引發(fā)的疾病，且其耐藥性也不斷增強(qiáng)，已被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為“15種嚴(yán)重耐藥的病原菌”之一。因此，沙門菌作為“對(duì)公共衛(wèi)生最具威脅的細(xì)菌”之一，對(duì)其致病機(jī)制的深入備受關(guān)注。
在侵染宿主過(guò)程中，沙門菌面臨一系列生存壓力，包括營(yíng)養(yǎng)匱乏、環(huán)境變化、宿主免疫系統(tǒng)的攻擊、以及抗生素的殺傷，宿主通過(guò)這些不利壓力環(huán)境來(lái)快速殺滅沙門菌。然而，在與宿主相互作用過(guò)程中，沙門菌通過(guò)一系列適應(yīng)性防御機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)。鞭毛作為沙門菌的運(yùn)動(dòng)器官，不僅通過(guò)趨化性引導(dǎo)沙門菌找到最佳的感染部位，還幫助其逃避宿主免疫細(xì)胞的捕獲。生物膜可作為自我保護(hù)屏障幫助沙門菌抵御宿主各種環(huán)境壓力、免疫系統(tǒng)攻擊和抗生素殺傷，從而提高沙門菌的生存能力。此外，沙門菌還可以通過(guò)調(diào)節(jié)關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平來(lái)增強(qiáng)其對(duì)抗生素的耐受性。這些機(jī)制不僅增強(qiáng)了沙門菌在宿主體內(nèi)的生存和繁殖能力，還可導(dǎo)致其耐藥性的產(chǎn)生，增加治療的難度。因此，探究沙門菌所面臨的生存壓力及其應(yīng)對(duì)機(jī)制對(duì)開(kāi)發(fā)新的抗菌藥物靶標(biāo)和制定有效預(yù)防策略至關(guān)重要。
YchJ是細(xì)菌的未知功能蛋白之一，其相關(guān)研究鮮有報(bào)道。前期研究表明，YchJ影響大腸埃希菌生物膜的形成和蛋白質(zhì)的分泌，提示YchJ可能在大腸埃希菌的抗逆能力中發(fā)揮重要作用。目前，沙門菌YchJ蛋白功能的相關(guān)及該基因缺失后對(duì)于菌株的影響尚不清楚。因此，本研究基于CRISPRCas9技術(shù)成功構(gòu)建鼠傷寒沙門菌ychJ基因敲除株，比較野生株和敲除株的運(yùn)動(dòng)能力、生物膜形成能力和抗生素耐受能力，旨在為沙門菌及胞內(nèi)寄生菌YchJ功能的確定提供理論基礎(chǔ)。
1、材料與方法
1.1菌株及質(zhì)粒
鼠傷寒沙門菌ATCC14028s（WT菌株）菌株購(gòu)于美國(guó)ATCC菌種庫(kù)，CRISPRB質(zhì)粒購(gòu)于廣州源井生物科技有限公司。
1.2主要試劑和儀器
引物序列由鉑尚公司合成；PCR基因擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；氨芐青霉素（Amp）和諾氟沙星購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自南京諾維贊公司；mRNA提取試劑盒購(gòu)自山東思科捷生物技術(shù)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自Takara寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀以及生長(zhǎng)曲線分析儀專用微孔板均購(gòu)自丹麥Biosense公司。
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