轉錄水平解析昆蟲病原線蟲共生菌菌株新型殺菌蛋白PPIA-L20基因表達調控——摘要、引言
[目的]前期從廣譜抗菌的Xenorhabdus bovienii NN6菌株的胞外蛋白中分離出一種新型殺菌蛋白PPIA-L20，為肽基脯氨酰異構酶A類似物，該蛋白能夠抑制尖孢鐮刀菌西瓜專化型的孢子的萌發(fā)，致使孢子死亡。經過多次試驗驗證ppia-l20 基因的表達水平不穩(wěn)定，與發(fā)酵時間沒有明顯的相關性。本文旨在探尋調控ppia-l20基因表達的調控因子，進而推測ppia-l20基因表達調控的分子機制，為進一步提高抗菌蛋白的產量提供參考。[方法]對ppia-l20的轉錄水平進行Real-time PCR分析并與菌株生長曲線進行相關性分析，選擇ppia-l20基因表達量差異顯著的2個發(fā)酵時間點進行轉錄組學比較，并對表達差異顯著的DEG(differential expressed gene)進行GO功能注釋、KEGG富集通路和蛋白網絡互作分析。[結果]4～84 h發(fā)酵菌體中的ppia-l20基因表達趨勢不穩(wěn)定，其轉錄水平與時間不相關。與ppia-l20低表達量的8 h發(fā)酵菌體相比，ppia-l20高表達量的12 h發(fā)酵菌體中有466個DEG，包括193個上調基因和273個下調基因。Real-time PCR驗證表明基因表達差異趨勢與轉錄組測序結果一致，證明測序結果可信。對差異表達的基因進行GO功能注釋、KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)DEG的功能與膜形成相關，富集通路與雙組分調節(jié)系統(tǒng)、磷酸轉移酶系統(tǒng)和陽離子抗菌肽抵制通路相關。其中，雙組分調節(jié)系統(tǒng)中的qseC基因和opmR基因表達量均上調2倍，ppia-l20基因位于陽離子抗菌肽抵制通路，該通路上的nlpE基因(負責編碼外膜脂蛋白)顯著下調。蛋白互作網絡中，PPIA-L20蛋白與位于外膜的AMP結合蛋白TycC、GrsB有互作關系，NlpE蛋白與雙組分調節(jié)系統(tǒng)中cpxR基因、cpxA基因表達的蛋白有互作關系。[結論]Xenorhabdus bovienii NN6菌株可能通過雙組分調節(jié)系統(tǒng)通路、陽離子抗菌肽抵制通路上的關鍵基因nlpE和磷酸轉移酶系統(tǒng)共同調控ppia-l20的表達。
引言
昆蟲病原線蟲共生菌(entomopathogenic nematode symbiotic bacteria)是一類與昆蟲病原線蟲(entomopathogenic nematode，EPN)共生的細菌，包括致病桿菌屬(Xenorhabdus)和發(fā)光桿菌屬(Photorhabdus)及沙雷氏菌屬(Serratia)的部分種。由于該類共生菌能夠產生多種殺蟲及抑菌活性物質，已成為植物病蟲害生物防治的重要資源。目前已分離純化得到的抑菌產物多數(shù)來源于Xenorhabdus屬昆蟲病原線蟲共生菌，如吲哚類化合物、水溶性小肽類抗菌化合物(xenocoumacin1，XCN1)、二硫吡咯酮類、蒽醌類、呋喃酮類和抗菌肽等小分子物質，以及蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、DNA酶和幾丁質酶等大分子物質。Gualtieri等從Xenorhabdus nematophila F1菌株中分離出富含賴氨酸的PAX肽類，其中PAX1-5對植物病原菌和人類條件病菌尖孢鐮刀菌有抑制作用。Xiao等從Xenorhabdus budapestensis NMC-10分離出2種抗菌肽GP-19和EP-20，對辣椒疫霉和辣椒黃萎病有較強的抑制效果。Chen等發(fā)現(xiàn)嗜線蟲Xenenorhabdus nematophilus和Xenorhabdus bovienii能夠產生胞外幾丁質酶和胞內幾丁質酶用于殺蟲活性。細菌產生的殺蟲及抑菌活性毒力因子受到多種信號轉導系統(tǒng)的調控，信號轉導系統(tǒng)用于調節(jié)生理活動、毒力、耐藥性等，其中細菌雙組分調節(jié)系統(tǒng)(two-component system，TCS)是微生物感知和響應外部和/或膜內刺激的主要機制。TCS不僅參與調控毒力因子產生，而且還調節(jié)抗生素耐藥性的基因表達。目前，關于Xenorhabdus屬抗菌蛋白表達調控的研究較少。
本課題組前期從1株廣譜抗菌的Xenorhabdus屬昆蟲病原線蟲共生菌菌株X.bovienii NN6的胞外蛋白中，分離純化得到1種新型殺菌蛋白PPIA-L20，為肽基脯氨酰異構酶 A 類似物，該蛋白不僅在較低劑量就能致死尖孢鐮刀菌西瓜專化型(Fusariurn oxysporum f. sp. niveum，F(xiàn)ON)的孢子，而且對FON菌絲生長也有顯著的抑制效率。PPIA-L20是首次發(fā)現(xiàn)的具有殺菌作用的肽基脯氨酰異構酶 A 類似物，其基因表達調控機制尚不清楚。本研究利用轉錄組測序技術和實時熒光定量 PCR(real-time quantitative PCR)，對該基因表達情況和調控機制進行探究，嘗試從轉錄水平對抗菌蛋白表達調控進行解析，為其作為生防制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。
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