恒河猴肺中陰溝腸桿菌的分離鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)——摘要、材料和方法
陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)在自然界中廣泛存在，在人和動(dòng)物的糞便、水、泥土、植物中都可檢出。該菌為條件性致病菌，特定條件下能感染呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等多個(gè)器官系統(tǒng)，同時(shí)也可感染創(chuàng)口，嚴(yán)重時(shí)引發(fā)敗血癥等。老年人和抵抗力降低的病人是該菌的易感人群。該菌也可導(dǎo)致兒童腦膜炎、腦梗塞、腦膿腫和腦囊腫等疾病，甚至引起死亡。因此，陰溝腸桿菌已成為引起醫(yī)院內(nèi)感染的一種重要的病原菌。另外，陰溝腸桿菌B29是國(guó)際上公認(rèn)的“肥胖細(xì)菌”，它是造成肥胖的直接元兇之一。大量研究報(bào)道，由于抗生素類藥物的不合理使用，使陰溝腸桿菌對(duì)多種抗菌藥物具有較高的耐藥性，陰溝腸桿菌普遍對(duì)第一代至第四代頭孢類、青霉素類等藥物有90%以上的耐藥率，這為臨床用藥的選擇帶來(lái)很大困難。經(jīng)過(guò)多年對(duì)恒河猴的飼養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，恒河猴呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病率高，嚴(yán)重時(shí)可引起死亡。本文首次在恒河猴的肺組織中分離到陰溝腸桿菌，通過(guò)藥物敏感性試驗(yàn)，確定治療陰溝腸桿菌的首選藥物，為今后的臨床治療工作提供依據(jù)。
1、材料和方法
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
普通級(jí)雄性恒河猴1只，8歲，體重約7 kg。健康KM小鼠10只，雌性，6～8周齡。恒河猴及KM小鼠均來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所醫(yī)學(xué)靈長(zhǎng)類研究中心(恒河猴生產(chǎn)許可證號(hào)[SCXK(滇)K2015-0004]，使用許可證號(hào)[SYXK(滇)K2015-0006];KM小鼠生產(chǎn)許可證號(hào)[SCXK(滇)K2014-0002]，使用許可證號(hào)[SYXK(滇)K2014-0007])。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容經(jīng)本單位動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)審查通過(guò)(批準(zhǔn)號(hào):DWSP201902034)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道的關(guān)懷。
1.2主要試劑與儀器
SS瓊脂、GN增菌液、三糖鐵瓊脂，ID 32 E生化鑒定試條，藥敏紙片。電熱恒溫培養(yǎng)箱、ATB Expression儀。
圖1恒河猴病變
1.3實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1病例資料
該恒河猴身體健康，由人工飼養(yǎng)，每日喂以基礎(chǔ)飼料，自由飲水。每日清洗猴籠，定期消毒。通過(guò)日常飼養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)該恒河猴表現(xiàn)為呼吸困難，精神沉郁，厭食，活動(dòng)減少等癥狀，立即轉(zhuǎn)入治療室單籠飼養(yǎng)及治療，靜脈輸液青霉素(80萬(wàn)單位/次)3 d后病情好轉(zhuǎn)，停藥觀察，該猴精神及飲食情況并未完全恢復(fù)。在治療室內(nèi)隔離觀察20 d后放回大籠飼養(yǎng)，于放回大籠第2天死亡。尸檢外觀可見腹部鼓氣(見圖1A)，解剖心臟、肝、脾、胰腺、腎、腎上腺、膀胱未見異常，胃、腸管內(nèi)充氣(見圖1B)，部分腸道呈出血性炎性變化，雙肺下呈充血、出血，邊緣部分肉樣肺炎病變(見圖1C)。
1.3.2病料采集及培養(yǎng)
解剖柜條件下解剖死亡猴，用無(wú)菌手術(shù)剪切開肺組織，用滅菌接種環(huán)在肉眼病變明顯和正常肺組織部位采樣，接種于GN增菌液，在恒溫培養(yǎng)箱(37℃)內(nèi)增菌8 h后，接種SS瓊脂培養(yǎng)基，將平皿倒置放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果。
1.3.3細(xì)菌分離培養(yǎng)
挑選SS瓊脂培養(yǎng)基上典型菌落穿刺接種于三糖鐵瓊脂鑒別培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，作進(jìn)一步的分離培養(yǎng)和產(chǎn)酸產(chǎn)氣等培養(yǎng)特征的鑒定。同時(shí)挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。
1.3.4細(xì)菌生化鑒定
細(xì)菌生化鑒定采用法國(guó)生物梅里埃公司ATB細(xì)菌鑒定系統(tǒng)及配套ID 32E鑒定卡。按照說(shuō)明書，在鑒定卡中加入樣品后放37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，18～24 h內(nèi)觀察生化反應(yīng)結(jié)果。將反應(yīng)結(jié)果編號(hào)輸入ATB鑒定系統(tǒng)，判定結(jié)果。
1.3.5藥敏試驗(yàn)
用紙片擴(kuò)散法，對(duì)分離到的細(xì)菌進(jìn)行常用抗菌類藥物的敏感性試驗(yàn)。平皿置于37℃培養(yǎng)24 h后取出，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑大小(mm)。結(jié)果判定按美國(guó)CLSI的抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)操作方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。所用8種藥敏試紙片如下表。
表1藥敏紙片及規(guī)格
1.3.6病理檢查
取肉眼見明顯病變部位，4%甲醛溶液固定后制作病理切片，HE染色，鏡檢。
1.3.7小鼠致病性試驗(yàn)
用滅菌生理鹽水將分離純培養(yǎng)的細(xì)菌稀釋，ATB比濁儀調(diào)整菌液濃度為4 McF。設(shè)立實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組6只小鼠，腹腔注射菌液0.5 mL/只，對(duì)照組4只小鼠，腹腔注射滅菌生理鹽水0.5 mL/只。記錄發(fā)病及致死情況，解剖死亡小鼠，記錄病理變化，無(wú)菌條件下采集肺臟組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。
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