瘢痕疙瘩MSCs生長(zhǎng)曲線與發(fā)病機(jī)制研究（一）
目的探索獲得瘢痕疙瘩來(lái)源的高純度間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的培養(yǎng)方法。方法來(lái)源于第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院皮膚科住院的4例患者的瘢痕疙瘩標(biāo)本，所取病變部位均位于前胸及后背皮膚，采用DMEM∶F12/(100 mL/L)胎牛血清(FBS)初步培養(yǎng)，再改用低糖DMEM/(100 mL/L)FBS培養(yǎng)，接著用低糖DMEM/(10 mL/L)FBS培養(yǎng)，最后用無(wú)血清的干細(xì)胞培養(yǎng)基(SCM)培養(yǎng)，并通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)特征及應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)情況進(jìn)行鑒定。結(jié)果經(jīng)血清梯度培養(yǎng)后得到了長(zhǎng)梭形、形態(tài)均一，純度較高的纖維樣細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)后細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)情況為：CD29為99.99%，CD44為99.7%，CD45為0.69%，CD73為99.96%。結(jié)論血清濃度逐漸降低的梯度培養(yǎng)法可獲得高純度的瘢痕疙瘩MSCs。
瘢痕分為生理性瘢痕和病理性瘢痕，而病理性瘢痕又分為增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。瘢痕疙瘩主要由局部創(chuàng)傷和表皮異位等造成真皮損失和膠原的異常聚集所致，在臨床上表現(xiàn)為呈“蟹足樣”浸潤(rùn)性生長(zhǎng)[1]。一般不自行萎縮，切除后易于復(fù)發(fā)，但一般不會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移和惡變[2]。目前瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制不清，也無(wú)理想的治療方法[3]。而間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是來(lái)源于早期中胚層的一類多能干細(xì)胞，目前已經(jīng)從骨髓、骨膜、皮膚等組織處分離得到MSCs[4]。有報(bào)道表明，瘢痕疙瘩中MSCs的數(shù)量要比正常皮膚中的多[5]，但是其作用機(jī)制尚不明確。因此，對(duì)MSCs的研究成為瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制研究的一個(gè)重要方面。目前對(duì)于瘢痕疙瘩MSCs的分離培養(yǎng)一般借鑒正常皮膚MSCs的培養(yǎng)方法，但一般培養(yǎng)周期長(zhǎng)，和成纖維細(xì)胞呈混雜生長(zhǎng)，難以分離出純度高的干細(xì)胞。因此，探討瘢痕疙瘩MSCs的培養(yǎng)方法對(duì)瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制的研究具有重要的意義。
1材料與方法
1.1標(biāo)本來(lái)源瘢痕疙瘩標(biāo)本來(lái)源于第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院皮膚科住院的4例患者，患者均為初次就診，此前未接受過(guò)其他治療，無(wú)全身其他器質(zhì)性疾病，病變部位均位于前胸及后背。經(jīng)患者知情同意后，以手術(shù)及電子線照射治療瘢痕疙瘩病變，同時(shí)經(jīng)病理診斷確診為瘢痕疙瘩，留取標(biāo)本備用。
1.2主要試劑及儀器2.5 g/L胰蛋白酶(Hyclon)，胎牛血清(FBS，Gibco)，干細(xì)胞培養(yǎng)基(Cell Therapy Systems STEMPRO MSC SFM CTSTM,Gibco)，Ⅱ型中性蛋白酶(DispaseⅡ,Roche)，CD29-PerCP、CD44-FITC、CD45-PE、CD73-APC(eBioScience)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，高速低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson公司)。
1.3 MSCs原代分離用生理鹽水將瘢痕疙瘩標(biāo)本帶回實(shí)驗(yàn)室，并用生理鹽水涮洗3次，采用RIEKSTINA等[6]報(bào)道的正常皮膚MSCs的分離方法，將瘢痕疙瘩組織塊剪成條索狀，用25 g/LⅡ型中性蛋白酶37℃孵育2 h，在無(wú)菌條件下用鑷子輕輕撕去表皮，留下真皮。再將樣本剪成1 mm3大小的組織塊，D-Hanks緩沖液洗3次，2.5 g/L胰蛋白酶37℃消化15 min，加入含有100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，用吸管反復(fù)吹打乳糜狀組織塊使細(xì)胞分離，通過(guò)孔徑40μm的細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，濾液離心棄上清，加入含100 mL/L FBS和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM∶F12(1∶1)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)。
1.4 MSCs的培養(yǎng)及顯微鏡下的形態(tài)觀察采用CARLSON等[7]關(guān)于小鼠心肌MSCs的培養(yǎng)方法，用含100 mL/L FBS和1%雙抗的DMEM∶F12(1∶1)培養(yǎng)基于25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞，37℃、50 mL/L CO2條件下孵箱，10 d后改為含100 mL/L FBS的低糖DMEM的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，使MSC富集；再改用含10 mL/L FBS的低糖DMEM的培養(yǎng)基培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，直到長(zhǎng)梭形的細(xì)胞成為優(yōu)勢(shì)細(xì)胞；最后用含1 g/L的poly-D-賴氨酸的無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基(SCM)培養(yǎng)細(xì)胞[含低糖DMEM∶Ham’s F12(1∶1)、B27、抗生素、20 ng/mL EGF、10 ng/mL FGF-2、10 ng/mL LIF]，直到細(xì)胞完全融合后胰酶消化傳代。
1.5 MSCs表面標(biāo)志的鑒定取第3代貼壁細(xì)胞，胰蛋白酶37℃消化2 min，用含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心、棄上清液，加入PBS制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，PBS洗滌、離心后加入95μL的PBS重新懸浮細(xì)胞，分別滴加5μL的CD29-PerCP、CD44-FITC、CD45-PE和CD73-APC 4種熒光抗體，冰上避光孵育30 min，以1 000 r/min離心5 min，棄去含熒光抗體的PBS，再用PBS洗滌2次，除去未結(jié)合的熒光抗體。向細(xì)胞中加入500μL預(yù)冷的PBS，吹打混勻，轉(zhuǎn)移至流式管中，同時(shí)以未被抗體處理的MSCs作為陰性對(duì)照，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
1.6觀察MSCs生長(zhǎng)并繪制生長(zhǎng)曲線取第3代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后第1、2、3、4、5、6、7、8 d采用錐蟲(chóng)藍(lán)染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞并繪制生長(zhǎng)曲線。
瘢痕疙瘩MSCs生長(zhǎng)曲線與發(fā)病機(jī)制研究（一）
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