瘢痕疙瘩MSCs生長曲線與發病機制研究（一）
目的探索獲得瘢痕疙瘩來源的高純度間充質干細胞(MSCs)的培養方法。方法來源于第四軍醫大學唐都醫院皮膚科住院的4例患者的瘢痕疙瘩標本，所取病變部位均位于前胸及后背皮膚，采用DMEM∶F12/(100 mL/L)胎牛血清(FBS)初步培養，再改用低糖DMEM/(100 mL/L)FBS培養，接著用低糖DMEM/(10 mL/L)FBS培養，最后用無血清的干細胞培養基(SCM)培養，并通過觀察細胞形態特征及應用流式細胞術檢測細胞表面標記物的表達情況進行鑒定。結果經血清梯度培養后得到了長梭形、形態均一，純度較高的纖維樣細胞，經流式細胞儀檢測后細胞表面標記物表達情況為：CD29為99.99%，CD44為99.7%，CD45為0.69%，CD73為99.96%。結論血清濃度逐漸降低的梯度培養法可獲得高純度的瘢痕疙瘩MSCs。
瘢痕分為生理性瘢痕和病理性瘢痕，而病理性瘢痕又分為增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。瘢痕疙瘩主要由局部創傷和表皮異位等造成真皮損失和膠原的異常聚集所致，在臨床上表現為呈“蟹足樣”浸潤性生長[1]。一般不自行萎縮，切除后易于復發，但一般不會發生轉移和惡變[2]。目前瘢痕疙瘩的發病機制不清，也無理想的治療方法[3]。而間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是來源于早期中胚層的一類多能干細胞，目前已經從骨髓、骨膜、皮膚等組織處分離得到MSCs[4]。有報道表明，瘢痕疙瘩中MSCs的數量要比正常皮膚中的多[5]，但是其作用機制尚不明確。因此，對MSCs的研究成為瘢痕疙瘩發病機制研究的一個重要方面。目前對于瘢痕疙瘩MSCs的分離培養一般借鑒正常皮膚MSCs的培養方法，但一般培養周期長，和成纖維細胞呈混雜生長，難以分離出純度高的干細胞。因此，探討瘢痕疙瘩MSCs的培養方法對瘢痕疙瘩發病機制的研究具有重要的意義。
1材料與方法
1.1標本來源瘢痕疙瘩標本來源于第四軍醫大學唐都醫院皮膚科住院的4例患者，患者均為初次就診，此前未接受過其他治療，無全身其他器質性疾病，病變部位均位于前胸及后背。經患者知情同意后，以手術及電子線照射治療瘢痕疙瘩病變，同時經病理診斷確診為瘢痕疙瘩，留取標本備用。
1.2主要試劑及儀器2.5 g/L胰蛋白酶(Hyclon)，胎牛血清(FBS，Gibco)，干細胞培養基(Cell Therapy Systems STEMPRO MSC SFM CTSTM,Gibco)，Ⅱ型中性蛋白酶(DispaseⅡ,Roche)，CD29-PerCP、CD44-FITC、CD45-PE、CD73-APC(eBioScience)，CO2恒溫培養箱(美國Thermo公司)，高速低溫離心機(德國Eppendorf公司)，FACS Calibur流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)。
1.3 MSCs原代分離用生理鹽水將瘢痕疙瘩標本帶回實驗室，并用生理鹽水涮洗3次，采用RIEKSTINA等[6]報道的正常皮膚MSCs的分離方法，將瘢痕疙瘩組織塊剪成條索狀，用25 g/LⅡ型中性蛋白酶37℃孵育2 h，在無菌條件下用鑷子輕輕撕去表皮，留下真皮。再將樣本剪成1 mm3大小的組織塊，D-Hanks緩沖液洗3次，2.5 g/L胰蛋白酶37℃消化15 min，加入含有100 mL/L FBS的DMEM培養基終止消化，用吸管反復吹打乳糜狀組織塊使細胞分離，通過孔徑40μm的細胞濾網過濾，濾液離心棄上清，加入含100 mL/L FBS和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM∶F12(1∶1)培養基重懸細胞沉淀，轉移到細胞培養瓶進行培養。
1.4 MSCs的培養及顯微鏡下的形態觀察采用CARLSON等[7]關于小鼠心肌MSCs的培養方法，用含100 mL/L FBS和1%雙抗的DMEM∶F12(1∶1)培養基于25 cm2的細胞培養瓶培養細胞，37℃、50 mL/L CO2條件下孵箱，10 d后改為含100 mL/L FBS的低糖DMEM的培養基進行培養，使MSC富集；再改用含10 mL/L FBS的低糖DMEM的培養基培養，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，直到長梭形的細胞成為優勢細胞；最后用含1 g/L的poly-D-賴氨酸的無血清干細胞培養基(SCM)培養細胞[含低糖DMEM∶Ham’s F12(1∶1)、B27、抗生素、20 ng/mL EGF、10 ng/mL FGF-2、10 ng/mL LIF]，直到細胞完全融合后胰酶消化傳代。
1.5 MSCs表面標志的鑒定取第3代貼壁細胞，胰蛋白酶37℃消化2 min，用含100 mL/L FBS的DMEM培養基終止消化，離心、棄上清液，加入PBS制成單細胞懸液，調整細胞密度為1×106個/mL，PBS洗滌、離心后加入95μL的PBS重新懸浮細胞，分別滴加5μL的CD29-PerCP、CD44-FITC、CD45-PE和CD73-APC 4種熒光抗體，冰上避光孵育30 min，以1 000 r/min離心5 min，棄去含熒光抗體的PBS，再用PBS洗滌2次，除去未結合的熒光抗體。向細胞中加入500μL預冷的PBS，吹打混勻，轉移至流式管中，同時以未被抗體處理的MSCs作為陰性對照，上流式細胞儀進行檢測。
1.6觀察MSCs生長并繪制生長曲線取第3代細胞，調整細胞密度為1×104個/mL，接種于24孔細胞培養板中培養。分別于培養后第1、2、3、4、5、6、7、8 d采用錐蟲藍染色，計數活細胞并繪制生長曲線。