奧西替尼耐藥肺癌腦轉移顱內的原位PDX模型構建方法
奧希替尼是一種不可逆的EGFR酪氨酸激酶抑制劑，被批準用于EGFR敏感突變的非小細胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)患者的一線治療，及治療后出現T790M突變患者的二線治療。盡管有效，但隨著治療的推進，患者對奧希替尼出現耐藥性不可避免，需要保持患者特征的細胞和小鼠模型來研究奧西替尼的耐藥機制。
傳統的細胞系以及其注射小鼠構建的動物模型，因為其細胞經過反復傳代，丟失了患者的部分基因信息和表征。不能反映患者腫瘤的異質性、細胞之間的相互作用和精準判斷治療反應。患者來源腦腫瘤異體種植模型(Patient-derived xenograft,PDX)，是保存患者信息最全面、最能重復患者腦腫瘤生物學行為的模型，比傳統細胞系好，能夠準確模擬腫瘤異質性。另外一方面，從PDX轉化來的患者來源腫瘤(PDXC)也保留了原始腫瘤的基因組和轉錄組特征，可以用于快速的細胞實驗。
目前，學術界及商界常用于腦轉移瘤研究的是人源的非小細胞肺癌細胞株A549，PC9，小鼠肺癌細胞株(Lewis lung carcinoma cells，LLC)，這些傳統的細胞株構建的模型包括細胞和小鼠腦轉移瘤模型，均不同程度的丟失了部分患者的遺傳信息及表征，因此，需要構建患者來源肺癌腦轉移原位PDX小鼠模型及PDXC細胞模型。
一種奧西替尼耐藥肺癌腦轉移顱內的原位PDX模型構建方法，包括：
步驟A：獲取奧希替尼耐藥患者的腫瘤標本，對腫瘤標本進行剔除掉電凝燒灼部分的腫瘤細胞，留取活性部分腫瘤；
步驟B：將腫瘤細胞保存在無血清的DMEM離心管中；
步驟C：取出腫瘤細胞，在培養皿中切成小片，加入第一培養液培養后進行吹打，并離心后獲得單個細胞；
步驟D：立體定向儀固定，注射預設數量的腫瘤細胞至裸鼠的腦內；
步驟E：當小鼠出現體重明顯下降，食欲差、或者神經系統癥狀時，收取部分裸鼠大腦；步驟F：冠狀位切取有腫瘤的小鼠大腦，進行H＆amp;E切片染色及CK7、TTF-1免疫組化染色，與患者的H＆amp;E及免疫組化染色進行對比；
步驟G：在步驟F執行的同時，將剩余小鼠基于無菌顯微鑷分離顱內轉移瘤，完整將小鼠PDX腫瘤取出并保存至無菌培養皿，無菌刀片將腫瘤切除預設尺寸的小塊，無菌離心管收集預設尺寸的腫瘤小塊，加入第一預設容量的第一培養液在培養箱中培養預設時長；加入第二預設容量的第二培養液，離心去上清，再加入第三預設容量的第二培養液，吹打細胞團，再加入第二預設容量的第二培養液，過濾器過濾，收集細胞懸液并計數，每個培養瓶一百萬個細胞/10ml第二培養液接種，得到原位PDXC模型，并將部分細胞懸液繼續接種至裸鼠顱內進行傳代，完成耐藥肺癌腦轉移顱內原位PDX模型；
步驟H：在步驟G執行的同時，取部分細胞懸液中的細胞基于預設細胞數量接種于六孔板中的各個孔內，放入芬蘭Bioscreen全自動微生物生長曲線分析儀（BIOSCREEN C°PRO全自動生長曲線分析儀能夠高通量篩選目的菌株，并能在短時間內迅速完成培養條件的優化，因為BIOSCREEN C°PRO能夠全自動日夜工作、培養、振蕩、測量同步進行。），實時監控拍照，繪制生長曲線；
步驟I：將PDXC傳代3代后，取部分細胞進行奧希替尼藥物敏感性檢測，對照組為HCC4006細胞株。
相關新聞推薦
1、利用一次性生物反應器培養細胞，觀察細胞生長曲線及活率變化曲線
2、朱鹮細胞系的建立、體外生長特征、性染色體的熒光原位雜交鑒定（三）