朱鹮細(xì)胞系的建立、體外生長特征、性染色體的熒光原位雜交鑒定（三）
圖2朱鹮細(xì)胞的平滑肌肌動蛋白抗體免疫熒光染色
2.2朱鹮細(xì)胞生長特性分析
利用MTT法,我們測定了連續(xù)培養(yǎng)7 d的不同傳代數(shù)的朱鹮細(xì)胞生長情況。圖3為5、10、20和25代朱鹮細(xì)胞的生長曲線。體外培養(yǎng)的朱鹮細(xì)胞表現(xiàn)出了典型的“潛伏期—對數(shù)生長期—停滯期”的生長模式。在細(xì)胞傳代過程中,我們發(fā)現(xiàn)不同代數(shù)細(xì)胞的增殖能力和形成單層的時間有所不同。傳代數(shù)＜10的細(xì)胞,輪廓清晰、立體感強(qiáng)且增殖能力強(qiáng),3 d即可形成致密單層;傳代數(shù)＞15的細(xì)胞,形成單層的時間逐漸延長,到20代以后,細(xì)胞增殖能力明顯減慢,5 d才可形成單層;傳代數(shù)＞25的細(xì)胞,形態(tài)扁大,顯現(xiàn)衰老特征且不能再形成單層。因此,我們所建立的朱鹮細(xì)胞系為有限細(xì)胞系,為保證細(xì)胞的旺盛生長力,需在建系早期多凍存?zhèn)鞔鷶?shù)低的細(xì)胞,且要避免長時間連續(xù)傳代細(xì)胞。
圖3不同傳代數(shù)的朱鹮細(xì)胞生長曲線
2.3細(xì)胞遺傳學(xué)分析
為證實(shí)我們所建立的細(xì)胞系確實(shí)來源于朱鹮,排除培養(yǎng)過程中可能發(fā)生的細(xì)胞交叉污染,我們制備了這兩株培養(yǎng)朱鹮細(xì)胞的中期染色體,并進(jìn)行了以下細(xì)胞遺傳學(xué)分析。
染色體數(shù)目和形態(tài)鳥類染色體所具有的大量微小染色體在使用Giemsa染液染色時著色較淺(圖4A),在染色體分散不理想時不易計(jì)數(shù)。為了準(zhǔn)確計(jì)數(shù)微小染色體,我們采用能使所有鳥類染色體均勻著色的熒光染料碘化丙啶(propidium iodine,PI,Amresco)對所制備的中期染色體進(jìn)行染色(圖4B)。對100個中期分裂相的計(jì)數(shù)結(jié)果表明,細(xì)胞的染色體眾數(shù)為2n=68,包括性染色體在內(nèi)有10對大染色體,其余為微小染色體。我們的結(jié)果與Liu et al（1992)報道的朱鹮核型分析結(jié)果一致,證明我們所建立的細(xì)胞系確實(shí)來源于朱鹮。
帶型分析目前,有關(guān)朱鹮顯帶染色體未見報道。在本研究中,我們首次進(jìn)行了朱鹮染色體Ag帶、C帶(圖4C,D)和G帶(圖5)顯示。在所觀察的20個細(xì)胞中,銀染的核仁組織者區(qū)(nucleolar organizer region,NOR)分布在一對微小染色體上(圖4C,箭頭所示)。C帶(異染色質(zhì))主要分布在多數(shù)大染色體的著絲粒區(qū)域,微小染色體多為C帶陽性,表明其微小染色體含有豐富的異染色質(zhì)。W染色體和Z染色體的長臂末端均為C帶陽性(圖4D,箭頭所示)。朱鹮的染色體C帶與已報道的家雞的染色體C帶相似(Pollock&Fechheimer,1981)。圖5為朱鹮的G帶核型圖,染色體排列方式參照Liu et al(1992)的報道,按染色體的相對長度,從長到短進(jìn)行排列。G帶分析結(jié)果表明,除雌性性染色體為異配的ZW以及雄性性染色體為同配的ZZ外,雌、雄個體的G帶核型一致;Z染色體為中著絲粒染色體,相對長度僅次于第5號染色體;W染色體長度約為Z染色體的一半。這些結(jié)果與Liu et al(1992)的報道一致。雖然可以根據(jù)性染色體為同配或異配來鑒別鳥類的性別,但鳥類的W染色體較小,長度與一些較小的常染色體相當(dāng),因此,在常規(guī)染色的分裂相中,僅根據(jù)外形,很難準(zhǔn)確鑒別W染色體(Shields,1982)。對于朱鹮W染色體的形態(tài),Takasi&Sasaki（1974)的報道為亞端著絲粒染色體,Liu et al（1992)認(rèn)為是中著絲粒染色體,而我們的G帶核型分析支持其為亞端著絲粒染色體（圖5)。
圖4不同染色和顯帶的朱鹮染色體
圖5朱鹮的G帶核型
朱鹮性染色體鑒別在以前的研究中,通過流式分選,我們已獲得了石鸻(B.oedicnemus,鸻形目)的Z和W染色體特異探針(Nie et al,2009)。為準(zhǔn)確鑒別朱鹮的性染色體,特別是W染色體,我們利用石鸻的Z和W染色體特異探針,分別與雄、雌性朱鹮的中期分裂相進(jìn)行熒光原位雜交(圖6A,B)。在雄性朱鹮的中期分裂相中,石鸻的Z染色體探針涂染了一對中著絲粒染色體(圖6A),即Z染色體,與核型分析確定的Z染色體一致。在雌性朱鹮的中期分裂相中,石鸻的W染色體探針涂染了一條較小的亞端著絲粒染色體(圖6B),直接證明W染色體是一條較小的亞端著絲粒染色體(圖6C)。另外,石鸻的Z和W染色體探針分別在朱鹮的一對微小染色體和Z染色體長臂的末端有交叉雜交的信號。這種交叉雜交的信號,在以石鸻的Z和W染色體探針與家雞的中期分裂相進(jìn)行熒光原位雜交的實(shí)驗(yàn)中也曾被檢測到(Nie et al,2009),表明石鸻的Z和W染色體探針中包含有與被雜交的染色體同源的序列,這些同源的序列可能是重復(fù)序列。
圖6熒光原位雜交示例
近期,西安交通大學(xué)和華大基因已合作完成了朱鹮全基因組序列圖譜繪制。朱鹮體細(xì)胞系的成功建立,不僅保存了這一珍稀瀕危鳥類的遺傳資源,也為后續(xù)開展其基因定位和其它生物學(xué)研究提供了實(shí)驗(yàn)材料。在本研究中所建立的朱鹮體細(xì)胞培養(yǎng)的方法,也可以用于其他鳥類的體細(xì)胞系建立和保藏。
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