發根農桿菌Ri質粒構建燈盞花發根最優的培養體系（一）
為建立燈盞花的發根培養體系，用C58C1發根農桿菌空菌株和攜帶目的基因的菌株轉化燈盞花葉片獲得發根，測定發根的生長曲線，比較不同因素對發根生長量的影響。結果表明：利用發根農桿菌C58C1菌株成功從燈盞花中誘導出了發根，并建立了燈盞花發根最優的培養體系，其誘導的最佳農桿菌菌液濃度為OD600=0.6，最佳浸染時間為10 min，最佳共培養時間為2 d，在此條件下誘導率高達60%。經PCR鑒定證明Ri質粒的T-DNA已成功轉化燈盞花的發根。
燈盞花(Erigeronbreviscapus)又名燈盞細辛、短葶飛蓬，為菊科飛蓬屬多年生草本藥用植物，全草入藥。其主要有效成分為燈盞乙素，又名野黃芩苷。燈盞乙素具有舒張血管、改善微循環、抑制血小板及紅細胞聚集，治療冠心病、心絞痛、腎衰和高血脂癥等疾病，具多種作用。但是作為云南最有發展前景的藥物之一，卻面臨著因濫采濫挖及種質退化導致資源緊缺的嚴峻挑戰。因此，從處于代謝節點處的關鍵基因著手，改善燈盞花的種質，提高燈盞花素的含量成為亟待解決的問題。
目前，燈盞花種質資源的改善主要依靠人工栽培馴化，馴化改善的燈盞花品種中有效成分燈盞乙素雖然可達1.053%～2.628%，但仍有很大提升空間，而且還面臨著種質很容易退化的嚴重問題。植物細胞的遺傳轉化是植物基因工程的一個關鍵環節。以發根農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)Ri質粒為載體可將植物次生代謝物合成關鍵酶基因整合到植物基因組中并表達，從而達到穩定改良植物性狀、提高次生代謝物含量的目的。發根體系具有操作過程簡便，遺傳穩定性強，生長快、易于培養獲得轉基因材料等優勢，發展潛力巨大。
植物次生代謝工程技術的應用已在多種植物中取得成果，如將矮牽牛(Petuniahybrida)中黃酮代謝途徑中的查爾酮異構酶基因CHI導入西紅柿中并過量表達，使轉基因西紅柿中果皮黃酮醇含量提高了78倍。過量表達莨菪類生物堿合成的關鍵酶基因PMT和H6H，成功將莨菪轉基因發根中東莨菪堿的含量提高了9倍。過表達丹參JAs合成途徑中的關鍵酶基因AOC、AOS和JMT，顯著提高了丹參發根中丹參酮ⅡA的含量。過量表達關鍵酶基因PLR成功提高了菘藍發根中落葉松脂素的含量等。而對于燈盞花，目前尚無建立遺傳轉化體系的報道。
本研究利用發根農桿菌Ri質粒成功地從燈盞花葉片誘導出發根，初步建立了最適燈盞花發根培養的遺傳轉化培養體系，為進一步利用遺傳代謝工程手段調節燈盞花次生代謝物含量提供了可行方法，以期用此方法部分替代野生資源，減輕濫采濫挖現狀及解決種質退化問題。
1材料與方法
1.1材料與試劑
1.1.1材料來源
供試燈盞花種子由西南林業大學劉江華教授提供，農桿菌C58C1由第二軍醫大學藥學院保存。
1.1.2試劑
試驗用到的HgCl2，MS、B5、YEB等培養基，蔗糖，瓊脂，瓊脂糖凝膠，頭孢、潮霉素、利福平等抗生素，各試劑均為國產分析純試劑。rolB、rolC基因引物由蘇州金唯智生物公司合成。PCR反應的rTaqDNA聚合酶Mix購自Takara生物公司。
1.2試驗方法
1.2.1植物材料處理
燈盞花種子用0.1%升汞浸泡10 min消毒，無菌水沖洗3～5次，滅菌吸水紙吸除殘留水分。將滅菌種子播種到MS固體空白培養基上，置于4 000 lx、16 h日光照，25℃條件下培養。種子3～5 d后開始發芽，大約15 d后長出無菌實生苗，45～60 d長成可供剪取葉盤的燈盞花無菌苗。
1.2.2發根農桿菌菌株活化
取-80℃凍存的C58C1菌液，于含40 mg/L利福平(Rif)的YEB平板上劃線，28℃恒溫暗培養2 d。挑取單菌落于1 mL YEB(含40 mg/L Rif)液體培養基中活化培養12～16 h。取活化的C58C1菌液200μL加入到30 mL YEB(40 mg/L Rif)液體培養基中28℃，200 r/min振蕩培養至菌液OD600分別為0.4、0.6、0.8。常溫下，5 000 r/min離心10 min，去上清，分別加30 mL B5、1/2B5、1/2MS、MS(均含100μmol/L乙酰丁香酮)液體培養基重懸菌體，28℃，100 r/min振蕩孵育30 min，用以浸染葉盤。最后統計分析不同濃度的菌液對轉化效率的影響。