不同乙醇、乙酸、氯化鈉、濃度對小米醋發酵過程中醋酸菌生長曲線的影響（三）
2.2生理生化實驗結果
將前期分離篩選出的24株菌根據實驗方法1.3.3節進行生理生化實驗，結果如表1所示。24株菌在接觸酶、甘油生酮、乙醇氧化、發酵葡萄糖及產葡萄糖實驗中為陽性反應，在氧化酶、產水溶性色素中為陰性反應;在運動性實驗中，除菌株SY01、SY02、SY03、SH06、GL14、GL19為陰性反應外，其余菌株均為陽性反應;乳酸氧化實驗中，除菌株GL09、GL17、GL18、SZ21、RH22、XM23、XM24菌為陰性反應外，其余菌株為陽性;在乙酸氧化實驗中，除菌株RH05、SH06、GL09、GL11、SY15、GL16、SZ21、RH22外，其余菌株呈現陽性反應。
綜合以上生理生化實驗結果，對照《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》，初步確定24株菌為醋酸桿菌屬(Acetobacter)。
2.3定性實驗結果
將前期分離篩選出的24株菌根據實驗方法1.3.4.1節進行產酸定性實驗，結果如表2所示，除菌株GL09外，其他菌株均能產生明顯的紅褐色沉淀，說明菌株GL09不具備產醋酸能力，因此鑒定該菌株不屬于醋酸桿菌屬。
注:“-”表示無紅褐色，“+”表示紅褐色不明顯，“++”表示紅褐色較明顯，“+++”表示紅褐色明顯。
2.4醋酸菌定量實驗結果
產酸量是反映醋酸菌的重要指標，篩選產酸能力較強的醋酸菌對提高醋醅酸度，改善傳統食醋工藝具有重要作用。
本研究對比24株菌的產酸量，以AS1.41為對照菌。由圖2可知，從小米醋發酵過程醋液、醋醅樣品中共篩選出24株菌，菌株SY01、SY02、SH06、YH07、GL11以及GL19產酸能力強，其產酸量分別為43.05、45.30、43.35、49.50、45.45、49.95 g/L;菌株SY03、RH04、RH05、YH08、GL10、XM12、SY15、GL16、GL17、GL18產酸能力適中，產酸量分別為38.10、38.05、31.80、35.70、38.65、32.25、38.20、38.25、39.15、38.45 g/L;菌株XM13、GL14、SZ21與對照菌株AS1.41(27g/L)相差不大，產酸量分別為27.50、29.85、27.60 g/L;菌株XM20、RH22、XM23、XM24產酸量低于對照菌株AS1.41(27g/L)，產酸量分別為19.2、19.05、18.9、19.5 g/L。謝錦明在陜西民間醋醅中成功篩選出一株熱帶醋酸菌(Acetobacter tropicalis)，其產酸量高達42g/L。本實驗結果共有6菌株產酸達到42g/L以上，與謝錦明研究結果相比，菌株產酸能力較強。
2.5醋酸菌耐受性實驗結果
2.5.1耐乙醇能力分析
通過前期產酸定量實驗，共篩選出6株優良菌株，分析其乙醇耐受性。結果如圖3所示，乙醇從3%增加至11.0%過程中，各菌株生長量呈現下降趨勢，而產酸量呈現先增加后降低的趨勢。菌株AS1.41、SY01、YH07、GL11在3%乙醇時測得最大產酸量，其中AS1.41產酸為23.9g/L;菌株SY02、SH06、GL19在5%乙醇時生長量及產酸量較好，其中SY02產酸量最高，可達38g/L。當乙醇增至7%時，菌株SY01、SY02、SH06、YH07、GL11、GL19及對照菌生長量及產酸量呈下降趨勢，此時SY02產酸量最高為18.3g/L，而AS1.41產酸為9.6g/L。當乙醇增至7%~9%時，菌株SY02、SH06、GL19生長量仍分別為0.690、0.485、0.689，而其余4株菌生長量和產酸量均受到明顯影響，對照菌AS1.41停止產酸。因為乙醇有抑制細菌生長的作用，所以當初始乙醇添加量達到醋酸菌耐受臨界點時，菌種的生長變化慢，導致其產酸下降甚至停止。通過對比可知，菌株SY01、SY02、SH06在高濃度乙醇下生長量及產酸量優于其他4菌株，擁有較好的乙醇耐受性。
2.5.2耐氯化鈉能力分析
通過前期產酸定量實驗，共篩選出6株優良菌株，分析其氯化鈉耐受性。結果如圖4所示，氯化鈉質量濃度從2g/L增至6g/L時，菌株生長及產酸量基本不受影響;從4g/L增至8g/L時，對照菌生長量及產酸量呈現明顯下降趨勢;在質量濃度為10g/L時幾乎停止產酸;從2g/L增至6g/L時，菌株SY01、SY02、SH06、YH07、GL11及GL19生長量及產酸量受到較小影響;從6g/L增至10g/L時，菌株SY02、SH06、GL19生長量仍分別0.571、0.724、0.706，產酸量分別為12.60、13.80、17.84 g/L，而菌株SY01、YH07、GL11生長量和產酸量呈現明顯下降趨勢，謝錦明等研究發現，醋酸菌在氯化鈉濃度較低時仍可以生長，但隨著濃度增加生長會受到嚴重抑制，影響其產酸能力。總的來看，氯化鈉對菌株SY01、YH07、GL11生長影響較大，因此在培養時，氯化鈉盡量控制在6g/L以內，保證菌株能較好產酸及生長。通過比較可知，在一系列氯化鈉濃度下，菌株SY02、SH06、GL19生長量和產酸量能力優于其他菌，擁有較好的氯化鈉耐受性。
2.5.3耐乙酸能力分析
通過前期產酸定量實驗，共篩選出6株優良菌株，分析其乙酸耐受性。結果如圖5所示，隨著乙酸濃度不斷增加，7株菌產酸量均呈現先上升后下降的趨勢。當乙酸為2.0%時，GL11、GL19及對照菌產酸量達到最大，其中GL19及對照菌產酸量分別為42.90、28.95 g/L;當乙酸為3.0%時，菌株SY01、SY02、SH06、YH07產酸量達到最大，其中SY02產酸量最高為40.80g/L，而對照菌產酸量為24.60g/L;當乙酸從2.0%增至3.0%時，所有菌生長量及產酸量受到較小影響，當乙酸為4.0%時，菌株YH07、GL11及對照菌生長量受到明顯抑制，而SY01、SY02、SH06、GL19生長量分別為0.531、0.471、0.435、0.450，產酸量仍達到23 g/L以上，當乙酸為5.0%時，菌株SY01、SY02、SH06、YH07、GL19產酸量低于13g/L。因為過酸環境會影響醋酸菌生長，而醋酸菌產酸能力也與其機體內的酶有關，過酸和堿性的環境都會導致相關酶活力降低，從而影響醋酸菌產酸能力。通過對比可知，菌種SY01、SY02、SH06、GL19在乙酸存在下生長量及產酸量優于其他菌株，擁有較好的耐乙酸能力。
綜合以上耐受性結果發現，菌株SY02、SH06、GL19的耐醇、耐氯化鈉、耐酸能力較強，具體表現為:乙醇耐受可達9.0%，氯化鈉耐受可達10g/L，乙酸耐受可達4.0%。因此確定菌株SY02、SH06、GL19為目標菌株，用于后續研究。
2.6生長曲線測定結果
實驗篩選3株耐受性較強的菌株SY02、SH06和GL19，測定其生物量和生長曲線，結果如圖6所示，菌株SY02和SH06的活菌數及OD???值最大分別為1.755、0.967，36~48h處于穩定期，48h后活菌數開始呈現下降趨勢，逐漸進入衰亡期。菌株GL19的活菌數和OD值均在24~48h生長繁殖速度快，處于對數期，菌體最大濃度分別為6.87 lg CFU/mL，48~60h處于穩定期，60h后活菌數逐漸進入衰亡期。醋酸菌SY02、SH06、GL19都能在較短時間內進入對數期，在這個階段，菌體以幾何級數增長，對外界環境具有強大的抵抗力。
2.7分子生物學鑒定結果
2.7.1核苷酸序列分析
將菌株SY02、SH06及GL19的16S rDNA序列上傳到NCBI數據庫進行對比，結果見表3，對比發現3株菌株與序列號為NR_178820.1的A.pasteurianus同源性最高，相似度分別為99.50%、99.8%及99.78%。因而可確定篩選出來的3株菌均屬于巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus)。
3結論
本實驗從傳統固態小米醋的醋液及醋醅中篩選得到24株菌，經定性實驗、耐受性實驗等篩選出3株產酸能力達到43g/L以上，能耐受9%乙醇、10g/L氯化鈉和4.0%乙酸的優良醋酸菌;經分子生物學鑒定這3株菌均為巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurians)。
由于實驗采用的是固態發酵過程中的醋醅及醋液，篩選出來的菌種在原醋醅中占比不高，未開展接種強化發酵應用，后期可將篩選出來的優良醋酸菌強化應用到實際生產中，研究醋酸菌在醋酸發酵階段的微生物群落變化以及對風味形成機制的影響。