煙草黑脛病菌對氟嗎啉與甲霜靈的藥敏性分析（一）
煙草黑脛病(Tobacco black shank)是一種土傳病害，其病原菌為疫霉菌煙草變種(Phytophthora parasitica var.nicotianae)。20世紀80年代后期，由于我國煙草種植面積不斷擴大，從而使煙草黑脛病迅速擴展?；瘜W(xué)防治是煙草黑脛病防控的重要措施，其中甲霜靈、烯酰嗎啉、氟嗎啉、霜霉威、惡霉靈等殺菌劑在生產(chǎn)中使用較為廣泛。甲霜靈是苯酰胺類內(nèi)吸性殺菌劑，其作用機制為抑制病原菌的RNA聚合酶活性。目前不同的病原卵菌對甲霜靈均具有抗性，羧酸酰胺類殺菌劑作為苯酰胺類殺菌劑的替代藥劑，對病原卵菌具有高效的抑菌活性。氟嗎啉是一種肉桂酰胺類殺菌劑，對由霜霉屬、假霜霉屬、疫霉屬等引起的卵菌病害具有優(yōu)異的保護和治療效果，但關(guān)于煙草黑脛病菌對氟嗎啉的敏感性、抗藥性研究尚未見報道。
化學(xué)藥劑復(fù)配可以減少農(nóng)藥的使用量，延緩抗藥性的發(fā)生，降低生產(chǎn)成本，是抗性治理的重要措施之一。生防菌株是天然存在的生物活體，具有良好的環(huán)境相容性。“生物-化學(xué)”協(xié)同防治可減輕化學(xué)藥劑對環(huán)境的壓力，具有廣闊的應(yīng)用前景。研究表明，將枯草芽孢桿菌或井岡霉素與殺菌劑復(fù)配可防治多種作物病害。奚家勤等從煙草品種K326葉片中分離了一株內(nèi)生細菌ZY-9-13，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌，對包括煙草黑脛病在內(nèi)的多種病原菌均具有抑制作用，能抑制病原菌菌絲的生長和孢子的萌發(fā)。將該菌株與煙草育苗基質(zhì)混合使用或在煙草植株移栽時施入根際周圍，對煙草黑脛病的防治效果顯著。目前，防治煙草黑脛病的化學(xué)藥劑有限，將生防菌劑與化學(xué)藥劑協(xié)同配合防治煙草黑脛病的研究鮮見報道。為此，以從河南省分離的煙草黑脛病菌為試驗材料，測定氟嗎啉對煙草黑脛病菌的毒力，將氟嗎啉與甲霜靈進行二元復(fù)配，再以最佳比例的化學(xué)藥劑與解淀粉芽孢桿菌進行復(fù)配，評價其生物-化學(xué)協(xié)同作用的效果，旨在為降低殺菌劑的抗性風險、研制新型農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1煙草黑脛病菌的分離培養(yǎng)
2014—2015年從河南省三門峽市(澠池、陜縣、靈寶、盧氏)、南陽市(淅川、內(nèi)鄉(xiāng))、平頂山市(郟縣)、周口市(鹿邑)、洛陽市(伊川、洛寧、汝陽)共11個采樣點采集患黑脛病的煙株，將病組織表面消毒清洗，放在滅菌的燕麥培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)2~4 d，待長出菌絲后，再次純化培養(yǎng)煙草黑脛病菌。
1.2供試藥劑
氟嗎啉標準品(有效成分97%)，甲霜靈標準品(有效成分98%)，均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。用二甲基亞砜配置成105μg/mL的母液，置于4℃保存。
1.3藥劑敏感性測定
采用菌落生長速率法測定煙草黑脛病菌對甲霜靈和氟嗎啉的藥劑敏感性。將甲霜靈和氟嗎啉的母液分別配置成終濃度為0、0.1、0.3、0.6、1.0、3.0μg/mL和0、0.70、0.85、1.00、2.00、3.00μg/mL的藥液，按照1:1 000(體積比)等量加入燕麥培養(yǎng)基中，以只加二甲基亞砜的燕麥培養(yǎng)基為空白對照。用滅菌打孔器制取直徑為5 mm的菌餅，將菌餅菌絲面朝下接種于各個濃度的培養(yǎng)皿中央，每個濃度3次重復(fù)。25℃恒溫培養(yǎng)，待空白對照的菌落直徑生長到6~8 cm時，采用十字交叉法測定處理菌落的直徑。藥劑對病原菌菌絲生長抑制率的計算公式為：
以藥劑濃度的對數(shù)為x軸，抑制率的機率值為y軸，根據(jù)兩者間的線性關(guān)系，計算出毒力回歸曲線方程y=bx+a及其相關(guān)系數(shù)r，求出藥劑對病原菌的有效抑制中濃度EC50。根據(jù)煙草黑脛病菌敏感性的分布情況，建立煙草黑脛病菌對氟嗎啉的敏感基線。
1.4復(fù)配藥劑的聯(lián)合毒力測定
在單劑毒力測定的基礎(chǔ)上，按氟嗎啉:甲霜靈體積比為1:10、3:20、1:5、3:10、2:5、1:2、3:5、4:5、1:1、2:1、3:1、5:1共12個復(fù)配比例測定復(fù)配藥劑的抑菌率，每個復(fù)配比例設(shè)置6個濃度梯度，藥劑終濃度為0、0.3、0.5、0.7、1.0和3.0μg/mL。采用Wadley方法對復(fù)配制劑進行聯(lián)合作用評價，評價公式為：
式中：a、b分別為氟嗎啉與甲霜靈的復(fù)配比例，%；EC(A)50為氟嗎啉的有效抑制中濃度，μg/mL；EC(B)50為甲霜靈的有效抑制中濃度，μg/mL。
式中：EC50(th)為混劑的理論有效抑制中濃度，μg/mL；EC50(ob)為混劑的實測有效抑制中濃度，μg/mL。
SR≤0.5，表明兩種藥劑復(fù)配具有拮抗作用；SR在0.5~1.5時，表明兩種藥劑復(fù)配具有相加作用；SR≥1.5，表明兩種藥劑復(fù)配具有增效作用。
相關(guān)新聞推薦
1、滸苔多糖降解微生物采集、分離、篩選、鑒定及生長曲線測定（三）
3、?典型的傳統(tǒng)細菌計數(shù)方法兩大不足之處