國內新發病原牛皰疹病毒4型(BoHV-4)qPCR鑒定、分離及一步生長曲線測定（三）
2結果與分析
2.1分離病毒的細胞病變觀察
通過qPCR檢測收集到的30份生殖道拭子樣本，其中9份樣品為BoHV-4陽性。對陽性樣本進一步檢測均顯示為BoHV-1和BVDV陰性。將9份BoHV-4陽性樣本分別接種HeLa細胞，48 h后其中一個接種孔顯示出明顯的細胞病變，部分細胞出現圓縮，空泡化細胞增多，同時可觀察到細胞聚集，呈現出皰疹病毒典型的“葡萄串”樣病變(圖1)。陰性細胞正常，無細胞病變。隨后收集培養物，凍融3次后繼續傳代，傳至第3代，細胞病變穩定存在。
圖1 BoHV-4在HeLa細胞上產生的細胞病變(紅色箭頭所指為細胞病變)
2.2病毒分離株的鑒定
2.2.1分離株TL01的qPCR鑒定結果
收集傳代3次并穩定出現細胞病變的細胞培養物，提取核酸后進行qPCR檢測(圖2)。Ct值為22.35，陰、陽性對照成立，可以確定分離到的病毒為BoHV-4，且擴增BoHV-1和BVDV的qPCR結果為陰性，表明病毒分離傳代過程中無BoHV-1和BVDV污染，純凈性良好。
圖2分離病毒的qPCR擴增曲線
2.2.2病毒感染細胞的間接免疫熒光鑒定
以制備的BoHV-4 gB蛋白小鼠多克隆抗體為一抗，FITC標記的羊抗小鼠IgG為二抗，孵育完后對DAPI染色細胞核進行間接免疫熒光觀察。熒光顯微鏡下顯示，感染TL01的細胞中出現明顯的特異性綠色熒光，且綠色熒光信號與細胞病變一致，未感染病毒的陰性細胞中未出現綠色熒光(圖3)。
圖3病毒感染細胞的間接免疫熒光試驗鑒定
2.2.3病毒粒子的電鏡觀察
收集病毒感染后的細胞固定后制作超薄切片，電鏡圖片如圖4所示。在電子顯微鏡下可觀察到明顯的球形顆粒，有囊膜，包裝完整的病毒粒子大小為150～200 nm，符合皰疹病毒的形態特征。圖4中可觀察到細胞質中包裝完整的病毒顆粒以及包裝完成后即將釋放到細胞間隙的病毒顆粒。
圖4 TL01毒株的掃描電鏡觀察
2.2.4病毒生長曲線測定
為測定病毒生長動力學，HeLa細胞在指定時間點以MOI為0.1接種TL01。病毒滴度在6～36 h呈上升趨勢，在感染后36 h達到峰值(106.3 TCID50·mL-1)后下降(圖5)，表明TL01可以在HeLa細胞中有效感染和復制。
圖5 TL01的生長曲線
2.3分離病毒gB和TK基因的遺傳演化分析
對TK和gB基因進行擴增，電泳鑒定結果如圖6所示，TL01各基因片段與預期相符。對膠回收產物純化后測序獲得TL01的TK(GenBank ID:PP534476)和gB基因序列(PP534477)。BLAST搜索與其他BoHV-4毒株的相應序列有99%以上的同源性。
圖6 gB和TK基因PCR擴增產物的鑒定
利用系統發育分析軟件MEGA 11將TL01分離株gB和TK基因與GenBank中收錄的BoHV-4毒株相應基因型進行序列比對并構建系統發育樹。如圖7所示，基于gB基因的系統進化分析表明，TL01的gB基因與BoHV-4的基因2型代表毒株DN599的遺傳距離最近，在系統發育樹上的Bootstrap值為91%。同時與其他3株gB基因屬于BoHV-4的基因1型的中國分離株512、B6010、J4034的親緣關系較遠。基于TK基因的系統進化分析表明，TL01株的TK基因與基因1型代表毒株Movar33/63以及其他3株TK基因屬于基因1型的中國分離株512、B6010、J4034的親緣關系較近，在系統發育樹上的Bootstrap值為93%。
圖7基于gB(A)和TK(B)基因編碼氨基酸序列的系統發育分析
3討論
BoHV-4屬于皰疹病毒科γ皰疹病毒亞科的成員，其感染動物后的臨床癥狀主要與成母畜的繁殖障礙或生產性能下降相關，此外，BoHV-4感染最終導致胎盤細胞損傷和功能障礙，可能引發子宮的病變，并誘發流產，對畜牧業造成威脅。BoHV-4首次分離自匈牙利1至4月齡犢牛的呼吸系統疾病和結膜炎病例，并隨后在巴西、意大利、阿根廷等國家報道。2021年，該病毒在我國首次分離。目前國內沒有針對該病原診斷和防控的國家標準和行業標準，也沒有相應商品化疫苗生產，需要重視其流行病學特征及診斷和防控技術的研發。
目前對于BoHV-4的流行病學研究主要以血清學調查為主。1989至2005年，BoHV-4的全球血清陽性率在養牛場為4.2%～30%。在我國，從內蒙古自治區采集的70份牛血清中，有64%存在抗BoHV-4抗體。2023年，我們采集了東北地區某牧場12月齡荷斯坦牛的生殖道拭子并進行檢測，BoHV-4陽性率為30%，且未發現BoHV-1和BVDV的混合感染，提示BoHV-4可能在該牧場內發生傳播。目前BoHV-4在國內的流行病學研究較少，因此需要進一步流行病學調查為該病原的生物防控提供參考依據。
TL01株雖然可以在HeLa細胞上引起典型的細胞病變，但不產生噬斑，無法采用挑取空斑的方式對其進行純化，這可能是由于病毒不會殺死它們的宿主細胞，使其裂解、脫落產生空斑。為確保該病毒分離及傳代過程中的純凈度，在樣本采集時需要檢測是否還含有其他與生殖道疾病相關的病原，如BoHV-1、BVDV。普通PCR的敏感度較低，而染料法qPCR會出現一些非特異性擴增或引物二聚體影響結果準確性，因此，在試驗前期建立了針對BVDV、BoHV-1、BoHV-4特異性和準確性更高的探針法，確保分離毒株的純凈性。
限制性酶切法是BoHV-4經典的基因分型方法。gB和TK基因在皰疹病毒科成員中高度保守，已被廣泛用于分析BoHV-4毒株的基因型。因此，選擇擴增gB和TK基因構建系統發育樹，結果表明，TL01的gB基因屬于DN599-like型，特別的是它與NCBI上的3株中國分離株屬于不同的分支。由于gB蛋白是在病毒膜上最豐富的蛋白之一，其編碼基因是皰疹病毒科成員中最保守的一個基因，在病毒復制中是必需的，這種差異對病毒的吸附和侵入會有哪些影響，值得進一步研究。TK基因是病毒毒力基因，也是病毒復制的非必需基因，但對病毒維持神經組織的持續感染十分重要。TL01的TK基因與這3株中國分離株同屬于Movar33/63-like型，與gB基因分型不同，這可能是由于在遺傳進化過程中發生了病原內部的基因重組，表明BoHV-4遺傳進化的復雜性。TL01株的基因重組及分型情況依賴全基因組序列的測定與深入分析。
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