鴨瘟病毒DEV gG 基因缺失株的構(gòu)建、體外生長(zhǎng)曲線和蝕斑形成能力測(cè)定
鴨瘟病毒（DEV）是引起鴨高致死率的重要病原。為探究gG基因?qū)EV疫苗株免疫保護(hù)效果的影響，本研究在本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的DEV疫苗株細(xì)菌人工染色體感染性克隆pDEV-EF1的基礎(chǔ)上，通過(guò)“Red E/T兩步重組”技術(shù)，構(gòu)建DEV gG基因缺失的感染性克隆pDEV-ΔgG，對(duì)其進(jìn)行酶切、PCR及測(cè)序鑒定。將pDEV-EF1和pDEV-ΔgG分別轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞，待兩組細(xì)胞均出現(xiàn)熒光后，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次后，連續(xù)傳至20代，每隔5代采用PCR及測(cè)序鑒定，分析pDEV-ΔgG的遺傳穩(wěn)定性，并采用western blot進(jìn)一步鑒定，結(jié)果顯示，正確構(gòu)建gG基因缺失株，且能在CEF上穩(wěn)定傳代，命名為rDEV-ΔgG。將rDEV-ΔgG和親本病毒rDEV-EF1接種CEF，測(cè)定體外生長(zhǎng)曲線和測(cè)定蝕斑形成能力。
結(jié)果顯示，rDEV-ΔgG和rDEV-EF1的病毒滴度在24 h~72 h呈上升趨勢(shì)，均在72 h時(shí)達(dá)到高峰，且二者的病毒滴度無(wú)顯著差異；rDEV-ΔgG感染CEF后形成的蝕斑較親本病毒rDEVEF1產(chǎn)生的蝕斑面積減小27.37%。將rDEV-ΔgG以不同劑量免疫30日齡麻鴨2周后，進(jìn)行DEV攻毒試驗(yàn)，觀察各組鴨的臨床癥狀，統(tǒng)計(jì)各組麻鴨的存活率，攻毒后1 d到9 d采集各組鴨肛拭子，并在攻毒后2 d、4 d、6 d和8 d各組分別隨機(jī)剖殺3只麻鴨，取其各臟器組織，經(jīng)熒光定量PCR分別檢測(cè)各組麻鴨各臟器病毒載量及排毒情況。攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，1.0×105 TCID50和1.0×104 TCID50 rDEV-ΔgG免疫的麻鴨在強(qiáng)毒攻擊下的保護(hù)率較相同劑量rDEV-EF1免疫的麻鴨均下降17%。
各臟器病毒載量結(jié)果顯示，在攻毒后2 d麻鴨胸腺的病毒載量最高，其次是脾臟，在攻毒后4 d，麻鴨食道、泄殖腔、胸腺病毒載量較高。泄殖腔排毒結(jié)果顯示，攻毒后1 d~4 d泄殖腔排毒量持續(xù)升高，并攻毒后4 d各組麻鴨的排毒量達(dá)到峰值。本研究比較了gG基因缺失病毒rDEV-ΔgG和親本病毒rDEV-EF1的生物學(xué)特性和免疫保護(hù)效果差異，為明確gG在DEV基因組中的功能提供研究基礎(chǔ)。
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