基于超微藥粉瓊脂稀釋法檢測9種致病菌對常用15種中藥的敏感性（二）
2.2紙片法測定中藥水提液對致病菌的抑菌圈大小
選取致病菌敏感性不同的3種中藥（五倍子、地榆、石榴皮），按照中藥高壓水提液的制備方法制備藥敏實驗的藥液，然后依據紙片法測定此3種藥液對4株鰻鱺致病菌的抑菌圈大小，實驗結果見表2。從表2中數據可知，不同濃度藥液對4株鰻鱺致病菌的抑菌圈大小各不相同，隨濃度的升高呈增大趨勢。B01對3種藥液高度敏感的最小濃度分別是五倍子125 mg/l、地榆＞1 000 mg/l、石榴皮500 mg/l；B09對3種藥液高度敏感的最小濃度分別是五倍子500 mg/l、地榆500 mg/l、石榴皮500 mg/l；B14對3種藥液高度敏感的最小濃度分別是五倍子250 mg/l、地榆＞1 000 mg/l、石榴皮＞1 000 mg/l；B15對3種藥液高度敏感的最小濃度分別是五倍子250 mg/l、地榆250 mg/l、石榴皮＞1 000 mg/l。由此說明4株致病菌對五倍子均表現為高度敏感，B09、B15對地榆及B01、B09對石榴皮表現為高度敏感，B01、B14對地榆及B15對石榴皮顯示為中度敏感，而B14對石榴皮表現為不敏感。
2.3平板二倍稀釋法測定中藥水提液對致病菌的抑菌效果
表2紙片法檢測4株鰻鱺致病菌對3種中藥水提液的敏感度（平均抑菌圈直徑mm）
選取致病菌較敏感的8種中藥（見表3），采用平板二倍稀釋法進行藥敏實驗。從表3實驗數據可知：平板二倍稀釋法測定8種中藥抑制9株致病菌的平均MIC值比超微藥粉瓊脂稀釋法測定的結果均偏高，即靈敏度下降，但實驗數據總體趨勢相一致。
9株致病菌對五倍子仍然均呈現出高度敏感；對首烏藤除B19、B20為中度敏感外，其余7株菌均表現為高度敏感；對地榆高度敏感的菌株是B09、B15、B18、B20，比超微藥粉瓊脂稀釋法測得結果少一株B19，降為中度敏感；對石榴皮低敏感和不敏感的菌株是B10、B14、B15、B18、B20，比超微藥粉瓊脂稀釋法測得結果多了三株（B15、B18、B20）；對貫眾低敏感和不敏感的菌株是B09、B14、B15、B20、B27，比超微藥粉瓊脂稀釋法測得結果多了二株（B14、B15）；對大黃中度敏感的菌株是B01、B15，比超微藥粉瓊脂稀釋法測得結果少了一株B10；對黃芩除了B01、B19表現低度敏感外，其余均為不敏感；對虎杖高度敏感的菌株是B01、B18，比超微藥粉瓊脂稀釋法測得結果少了二株（B10、B14），降為中度敏感。
3討論
本實驗沒有選擇試管二倍稀釋法測定致病菌對中藥的敏感度，是因為中藥粗提液含有大量色素，顏色深，且不同中藥藥液的顏色各不相同，會影響最終結果的觀察判斷，故在初期篩選抗菌中藥的研究中不宜采用試管二倍稀釋法。因此，我們選擇藥敏紙片法和平板二倍稀釋法篩選抗菌中藥，測定中藥藥液的抑菌效果，與本文建立的超微藥粉瓊脂稀釋法進行比較，以確定該方法的可行性和可靠性。
表3平板二倍稀釋法測定各種中藥水提液的最低抑菌濃度MIC（mg/l）
3.1藥敏紙片法與超微藥粉瓊脂稀釋法的比較
針對9株致病菌從15種中藥篩選出具有高效抑菌作用的藥材。采用藥敏紙片法一次試驗需要制備81個瓊脂平板；而采用超微藥粉瓊脂稀釋法一次試驗只需要45個瓊脂平板。兩者相比，篩選工作量顯著減少，操作更快捷，實驗材料費大大降低。
前期預實驗結果顯示，由于受紙片上藥物含量的限制，低敏感度和不敏感的中藥對致病菌均不產生抑菌圈，且考慮到實驗操作量，故表2中只選擇抑菌效果較好的3種中藥（五倍子、地榆、石榴皮）和有代表性的4株致病菌進行比較實驗。從表1和表2中的實驗數據，采用超微藥粉瓊脂稀釋法測得有效抑菌濃度低于紙片法，即靈敏度相應提高，然而4株致病菌對中藥五倍子、地榆、石榴皮的分級敏感程度與紙片法檢測結果一致。
3.2平板二倍稀釋法與超微藥粉瓊脂稀釋法的比較
平板二倍稀釋法與紙片法所使用的藥物都是液體，在做藥敏實驗之前同樣都要通過耗時較長、操作較復雜的中藥提取工序。而超微藥粉瓊脂稀釋法，只需將中藥藥材進行超微粉碎處理即可，步驟簡單。由于藥材粉碎顆粒足夠細，達到了5～10μm，保證藥材中的有效成分在瓊脂培養基中可以充分溶出，無需再考慮有效成分提取率高低對藥敏結果的負面影響。
比較表1和表3的實驗數據，9株致病菌對8種不同中藥的敏感度顯示，超微藥粉瓊脂稀釋法測得平均最低抑菌濃度均低于平板二倍稀釋法，靈敏度明顯增加。雖然這兩種方法在抑菌濃度上測得數據有差異，個別菌株的敏感度級別發生變化，但不同中藥對某一株致病菌的抑制效應強弱是一致的。
超微藥粉瓊脂稀釋法測定的中藥MIC值均低于平板二倍稀釋法，原因在于平板二倍稀釋法使用的是中藥超微粉的高壓水提液，而超微藥粉瓊脂稀釋法是直接使用中藥超微粉；采用水煎煮、高壓抽提、超聲提取、微波提取或有機溶劑萃取等中藥粗提方法，均無法將中藥植物藥材細胞內的有效成分完全溶出，且提取過程也會造成有效成分的部分降解失活，故降低了抑菌效果；而本法將中藥超微粉直接添加入瓊脂培養基，在進行抑菌藥敏實驗過程中，微米級顆粒的藥粉一直存在于細菌培養基內，不斷釋放抗菌有效成分，可達到較高的抑菌濃度。故可避免由于中藥粗提方法選擇不當，造成有效物質提取率低，而容易在初步篩選時將高效的抗菌藥材遺漏等問題。
綜上所述，本文建立的抗菌中藥植物藥材的初步篩選方法——超微藥粉瓊脂稀釋法具有操作簡便、快捷、耗時短、處理量大（即每一個90 mm平皿可同時檢測9～12株致病菌對藥物的敏感度），實驗成本低，以及藥敏實驗結果準確可靠等優點，是一種高效率的藥敏實驗方法，在實驗研究中具有很好的應用價值，為開發和應用植物中藥提供基礎的參考數據。
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