基于革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)曲線等指標(biāo)評(píng)價(jià)纖維素基抑菌材料L-Met改性MCC(M-MCC)抑菌效果(三)
1.3.5.3 M-MCC處理下細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定
分別以1 MIC和2 MIC的M-MCC為處理組,空白組不加入抗菌劑,向其中分別加入200μL濃度為106 CFU/mL的菌懸液,置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃,每2 h在600 nm波長(zhǎng)處用酶標(biāo)儀測(cè)定OD600 nm,并記錄數(shù)據(jù),繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。
1.3.5.4 M-MCC對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響測(cè)定
將培養(yǎng)24 h的L.monocytogenes和S.aureus在8 000 r/min離心15 min,收集細(xì)胞沉淀,用無(wú)菌生理鹽水洗滌兩次,重懸至OD600 nm=0.6~0.8,作為初始菌溶液備用。以2 mL L.monocytogenes菌懸液+2 mL無(wú)菌葡萄糖水為空白對(duì)照組,以2 mL菌懸液+2 mL無(wú)菌葡萄糖水+2 MIC的M-MCC為1 MIC組,以2 mL菌懸液+2 mL無(wú)菌葡萄糖水+4 MIC的M-MCC為2 MIC組。于37℃恒溫培養(yǎng)6 h。在8 000 r/min將不同培養(yǎng)時(shí)間的混合液分別離心15 min,保留上清液,過(guò)0.22μm的濾膜,并用電導(dǎo)率儀測(cè)定過(guò)濾后上清液的電導(dǎo)率。
1.3.5.5 M-MCC對(duì)細(xì)胞內(nèi)容物的影響測(cè)定
通過(guò)測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞核酸及蛋白質(zhì)的泄漏情況確定M-MCC對(duì)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物的影響,其中利用紫外分光光度計(jì)在260 nm波長(zhǎng)處測(cè)定核酸吸收峰,在280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定蛋白質(zhì)吸收峰。
將培養(yǎng)24 h的L.monocytogenes和S.aureus在8 000 r/min離心15 min,并收集細(xì)胞沉淀,用無(wú)菌PBS洗滌兩次,重懸至OD600 nm=0.6~0.8,作為初始菌溶液備用。以4 mL菌懸液為空白對(duì)照組,以4 mL菌懸液+MIC的M-MCC為1 MIC組,以4 mL菌懸液+2 MIC的M-MCC為2 MIC組。于37℃恒溫培養(yǎng)0、30、60、90、120、150、180 min。在8 000 r/min將不同培養(yǎng)時(shí)間的混合液分別離心15 min,保留上清液,過(guò)0.22μm濾膜,使用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定260 nm和280 nm波長(zhǎng)處的吸光度。
1.3.5.6 M-MCC對(duì)細(xì)胞DNA含量的影響測(cè)定
將培養(yǎng)24 h的L.monocytogenes和S.aureus在8 000 r/min離心15 min,并收集細(xì)胞沉淀,用無(wú)菌PBS洗滌兩次,重懸至OD600 nm=0.6~0.8,作為初始菌溶液備用。以2 mL菌懸液為空白對(duì)照組,以2 mL菌懸液+MIC的M-MCC為1 MIC組,以2 mL菌懸液+2 MIC的M-MCC為2 MIC組。于37℃恒溫培養(yǎng)4 h。向各組中加入20μL 1 mg/mL的DAPI,充分混勻并在遮光條件下反應(yīng)10 min。取20μL溶液滴加至載玻片上,加蓋玻片,通過(guò)激光共聚焦顯微鏡(64×)進(jìn)行觀察,激光共聚焦顯微鏡的激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為405 nm,發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)置為461 nm。
1.4數(shù)據(jù)處理
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及圖由Excel 2021軟件和Origin 2021 Pro軟件處理。
2結(jié)果與分析
2.1表征分析結(jié)果
2.1.1微觀形貌及結(jié)構(gòu)分析
為了了解L-Met修飾對(duì)MCC形貌結(jié)構(gòu)的影響,觀察MCC和M-MCC的微觀形貌和結(jié)構(gòu)變化,采用SEM對(duì)MCC和M-MCC成像,結(jié)果如圖2所示。與具有多孔結(jié)構(gòu)、呈現(xiàn)短棒狀的MCC相比,L-Met修飾的M-MCC表現(xiàn)出更粗糙的表面,呈片狀分布,且表面覆蓋有顆粒狀纖維。這種表面結(jié)構(gòu)改變可能有助于增加M-MCC對(duì)細(xì)菌的接觸面積,進(jìn)而提高抗菌活性,這有待進(jìn)一步的確定。
圖2 MCC與M-MCC的微觀形貌
2.1.2表面官能團(tuán)及元素分析
使用FTIR對(duì)改性前的MCC和改性后的M-MCC表面官能團(tuán)進(jìn)行表征,結(jié)果如圖3所示。在3 337、1 634、1 430、1 320、1 166 cm-1和1 031 cm-1處MCC和M-MCC具有相同的峰,分別對(duì)應(yīng)—OH拉伸振動(dòng)峰、—OH彎曲振動(dòng)吸收峰、—H—C—H—面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰、—O—C—H面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰、—C—O—C—不對(duì)稱(chēng)拉伸振動(dòng)峰和—C—O—拉伸振動(dòng)峰,這證明改性后MCC骨架結(jié)構(gòu)不變,說(shuō)明L-Met的接枝并沒(méi)有破壞纖維素的基本骨架結(jié)構(gòu)。—C—S—C—的紅外吸收峰出現(xiàn)在1 024 cm-1處,1 630~1 680 cm-1碳氧伸縮振動(dòng)和1 460~1 550 cm-1氮?dú)鋸澢駝?dòng)證明了酰胺鍵的存在,間接證明了L-Met成功接枝到MCC表面。
圖3 MCC和M-MCC的FTIR
為了進(jìn)一步了解M-MCC的元素分布情況,采用SEM-EDS和XPS分別對(duì)C、O、N、S進(jìn)行元素分析。M-MCC中的元素分布情況如圖4A所示,包含C、O、N、S的EDS總譜圖如圖4B所示,可以看出,在M-MCC上可以檢測(cè)到N、S元素,而這兩種元素MCC本身不具備,由于L-Met接枝負(fù)載在MCC上而出現(xiàn),這證明L-Met成功接枝到了MCC上。在能譜總譜圖中能夠觀察到N、S的特征峰,也證明了這一結(jié)論。
圖4 M-MCC的表面官能團(tuán)分析
如圖4C所示,M-MCC由于分子中N、S元素含量較少,全譜分析中并未能直接看到N元素(N1s)和S元素(S2p)的結(jié)合峰。M-MCC的C1s結(jié)合能為286.11 eV,O1s結(jié)合能為532.5 eV。進(jìn)一步對(duì)N1s和S2p的特征譜峰進(jìn)行精細(xì)掃描分析,由峰形可以判斷出N、S元素的存在,但其較小的峰面積和峰強(qiáng)度也證實(shí)了N、S元素在M-MCC中含量較低。M-MCC的原子百分比如表1所示。由XPS所得到的N、S元素在M-MCC上的原子百分比僅為0.94%和0.55%,而C、O元素原子百分比則高達(dá)57.61%和40.91%。
表1 M-MCC的元素分析
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