白馬耳組織成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)、冷凍前及復(fù)蘇后存活率、生長曲線繪制（一）
摘要:本研究以內(nèi)蒙古烏珠穆沁白馬(Equus caballus)雄性和雌性為實驗材料，利用組織塊貼壁培養(yǎng)法進行耳組織成纖維細(xì)胞原代建系，研究耳組織來源的細(xì)胞貼壁率、冷凍前及復(fù)蘇后存活率、生長曲線，進一步繪制烏珠穆沁白馬成纖維細(xì)胞核型圖。實驗結(jié)果顯示，雌、雄烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞經(jīng)組織貼壁法建系培養(yǎng)，生長為典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)，并呈現(xiàn)“S”型生長曲線特征;細(xì)胞冷凍前后存活率存在顯著差異，但仍具有較好的耐受冷凍性;根據(jù)染色體核型分析，雌、雄烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞染色體條數(shù)為2n=64，其中31對常染色體，1對性染色體。本研究成功建立了雌、雄烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞系，并且得到可穩(wěn)定培養(yǎng)、具有良好遺傳學(xué)特性的細(xì)胞系，為后續(xù)的相關(guān)深入研究奠定了基礎(chǔ)。
烏珠穆沁白馬(Equus caballus)，蒙古名為烏珠穆沁查干阿都，是蒙古馬中的優(yōu)良品系，主要繁殖于內(nèi)蒙古錫林郭勒盟西烏珠穆沁旗草原上。西烏珠穆沁草原是具有代表性的中國溫帶典型草原，總面積22960km2，是唯一匯集內(nèi)蒙古九大類型草原的地區(qū)，也是中國北方草原最華麗、最壯美的地段，素有“天堂草原”之稱。
我國對于烏珠穆沁白馬的研究主要對不同年齡段的體高、體長、體重等體尺性狀和非遺傳因素、毛色特征、肉品質(zhì)三方面進行了研究(敖敏2019)。除此之外，對烏珠穆沁白馬馬肉的營養(yǎng)成分測定和奶制品的營養(yǎng)成分的測定、分析以及與其他品種的比較分析(旭仁其木格2018，趙雪妮2021)。目前大量的馬種資源處于數(shù)量下降、瀕危或瀕臨滅絕狀態(tài)，同時，目前是馬種資源的保種和向非役用轉(zhuǎn)型的關(guān)鍵時期(韓國才2014)，而細(xì)胞建系是物種遺傳資源保護的重要途徑，可為未來深入研究奠定基礎(chǔ)。
本研究利用烏珠穆沁白馬雄性和雌性耳組織成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)建立烏珠穆沁白馬體細(xì)胞系，在此基礎(chǔ)上對建成的體細(xì)胞系進行形態(tài)、貼壁率、凍存率、生長速度、核型等生物學(xué)特性分析，為其保護和開發(fā)利用提供參考。
1材料與方法
1.1實驗材料
取雌(32#耳號14798)和雄(18#耳號14250)各一匹烏珠穆沁白馬的耳部組織(材料采集是在不影響動物個體健康狀況的情況下進行的，符合動物倫理)用75%的酒精消毒，裝入含有青霉素-鏈霉素雙抗的無菌生理鹽水的50ml離心管內(nèi)，帶回實驗室。再用75%的酒精再次消毒組織塊，然后浸泡在無菌生理鹽水中用PBS清洗3次，按照組織貼壁培養(yǎng)方法進行無菌接種培養(yǎng)(劉建等2018)。
1.2實驗方法
1.2.1烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)及傳代純化培養(yǎng)
將生理鹽水中保存的烏珠穆沁白馬耳組織塊置于30mm培養(yǎng)皿中用75%的酒精中浸泡30s，再用DPBS緩沖液清洗5次。在30mm培養(yǎng)皿中用眼科鑷鑷夾住組織塊，將其剪成0.5~1mm3的小組織塊，然后均勻地鋪在T25培養(yǎng)瓶(康寧)中，倒置培養(yǎng)瓶并加入含有1%青霉素-鏈霉素雙抗和10%特級胎牛血清(foetal bovine serum，F(xiàn)BS)的MEM-Alpha培養(yǎng)液(gibco賽默飛)5ml，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，6~8h后緩慢將T25培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)進行原代建系培養(yǎng)(穆瑤等2019)。
當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)3~4d后，培養(yǎng)液變黃時需要更換新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)原代細(xì)胞培養(yǎng)生長至匯合度大于80%時，棄掉培養(yǎng)液，加入2ml DPBS輕輕晃動培養(yǎng)瓶沖洗細(xì)胞后棄掉廢液，再加入2ml胰蛋白酶消化液在培養(yǎng)箱中靜置消化細(xì)胞2~3min，直至在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變成圓形或呈漂浮狀態(tài)時，立即加入4ml已預(yù)熱的培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打細(xì)胞使貼壁細(xì)胞脫落，得到單細(xì)胞懸液。由原代細(xì)胞直接進行傳代時單細(xì)胞懸液中有較多組織塊，需用過濾器將組織塊過濾掉。將單細(xì)胞懸液1300 r/min離心3min后棄掉上清，收集細(xì)胞沉淀。再加入3ml預(yù)熱培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞按傳代比例接種于T25培養(yǎng)瓶中，并用培養(yǎng)液補充至每瓶5ml，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，觀察細(xì)胞生長情況并拍照記錄。
1.2.2烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細(xì)胞支原體檢測
本實驗使用BI-20-70020支原體檢測試劑盒進行檢測。在細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，取1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液上清液200r/min離心3~5min收集上清液。將上清液13000r/min離心10 min收集沉淀。用50μl緩沖液重懸沉淀并充分混勻，于95℃干浴器上加熱3min，得到檢測樣本。按照說明書配制PCR體系，包括檢測樣本(H2O29μl;反應(yīng)混合物10μl;檢測樣本5μl;內(nèi)控DNA模板1μl;內(nèi)控引物混合物5μl)、陰性對照(H2O29μl;反應(yīng)混合物10μl;H2O5μl;內(nèi)控DNA模板1μl;內(nèi)控引物混合物5μl)、陽性對照(H2O33μl;反應(yīng)混合物10μl;內(nèi)控DNA模板1μl;內(nèi)控引物混合物5μl;陽性對照DNA模板1μl)。使用40μl礦物油覆蓋反應(yīng)物，防止蒸發(fā)。設(shè)置PCR反應(yīng)參數(shù):預(yù)變性94℃30s;變性94℃30s，退火60℃120s，延伸72℃60s，35個循環(huán);循環(huán)結(jié)束后變性94℃30s，退火60℃120s，延伸72℃5min;反應(yīng)結(jié)束后4℃保存。
使用2%瓊脂糖凝膠電泳對上述PCR產(chǎn)物進行檢測分析，使用凝膠成像儀拍照對比檢測樣本、陽性對照、陰性對照條帶，確定檢測樣本是否存在支原體污染。支原體檢測陽性模板為357bp和270bp兩條帶，其中270bp為支原體污染后顯示的條帶，支原體檢測陰性模板條帶為357bp，如出現(xiàn)樣品出現(xiàn)270bp條帶，則認(rèn)為存在支原體污染。
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