大腸桿菌噬菌體Φ199一步生長曲線、與鹽酸克林霉素體外聯(lián)合應(yīng)用效果（三）
2.3噬菌體Φ199一步生長曲線
如圖4示，噬菌體Φ199在前5 min內(nèi)效價無明顯變化，5~10 min內(nèi)效價急劇升高，然后趨于穩(wěn)定。裂解量=裂解期平均噬菌斑數(shù)/潛伏期平均噬菌斑數(shù)。噬菌體Φ199的潛伏期為5 min，裂解期為5 min，裂解量為44。
(圖4：噬菌體Φ199一步生長曲線)
2.4噬菌體Φ199體外裂解曲線測定
將噬菌體Φ199與宿主菌以最佳MOI混合培養(yǎng)并持續(xù)觀察12 h，結(jié)果如圖5所示。在前3 h內(nèi)，噬菌體Φ199能夠完全抑制大腸桿菌O157:H7的生長，未加噬菌體的大腸桿菌O157:H7則保持持續(xù)增長，空白對照組則未見細(xì)菌增長。
(圖5：噬菌體Φ199體外裂解曲線)
2.5噬菌體Φ199熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性
如圖6所示，在40~60℃時噬菌體Φ199能夠穩(wěn)定存在，在70、80℃時噬菌體效價在1.5 h內(nèi)急劇下降，在90℃孵育30 min后噬菌體效價降低至0。以上結(jié)果表明，噬菌體Φ199在40~60℃范圍內(nèi)活性比較穩(wěn)定，在70℃及以上溫度下較難長時間生存。
(圖6：噬菌體Φ199溫度敏感性)
(圖7：噬菌體Φ199 pH值敏感性)
如圖7所示，噬菌體Φ199在pH值為3~12時具有較好的活性，pH值為2和13時完全喪失活性。這些結(jié)果表明噬菌體Φ199對酸堿具有一定的耐受性，在pH值3~12時可以穩(wěn)定存在。
2.6鹽酸克林霉素的MIC值
通過將細(xì)菌與不同濃度抗生素共同孵育以探究大腸桿菌對鹽酸克林霉素的MIC，結(jié)果鹽酸克林霉素對大腸桿菌O157:H7的MIC為64μg/mL。
2.7噬菌體Φ199與鹽酸克林霉素體外抗菌應(yīng)用
將鹽酸克林霉素與噬菌體Φ199體外聯(lián)合應(yīng)用，旨在探索二者聯(lián)用效果。通過肉眼直接觀察噬菌體與細(xì)菌聯(lián)用后MIC的變化，結(jié)果如圖8A所示。當(dāng)噬菌體濃度為10^5 PFU/mL時，鹽酸克林霉素的MIC仍為64μg/mL；噬菌體濃度為10^6 PFU/mL和10^7 PFU/mL時，抗生素的有效濃度降為1/2 MIC；當(dāng)噬菌體濃度為10^8 PFU/mL時，抗生素的有效濃度降至1/4 MIC。
進一步檢測細(xì)菌OD600 nm值并計算抗菌效率，圖8B呈現(xiàn)了噬菌體與鹽酸克林霉素聯(lián)合應(yīng)用的效果，數(shù)值代表細(xì)菌的清除效率，數(shù)值越大，顏色越淺，表明清除細(xì)菌的效果越好，其結(jié)果與圖8A一致。
(圖8：鹽酸克林霉素與噬菌體Φ199聯(lián)合應(yīng)用的抗菌效果)
3討論
本研究檢測了以大腸桿菌O157:H7為宿主菌的噬菌體Φ199的生物學(xué)特性，并且噬菌體Φ199與鹽酸克林霉素聯(lián)用后能夠降低大腸桿菌對鹽酸克林霉素的MIC。噬菌體Φ199的生物學(xué)特性顯示，其最佳MOI為1，能夠在雙層瓊脂平板上形成清晰的噬菌斑。裂解曲線顯示，噬菌體Φ199能夠在3 h內(nèi)達(dá)到良好的抑菌效果。通過透射電鏡觀察到噬菌體Φ199屬于肌尾型噬菌體，具有直徑約為50 nm的頭部和長度約為100 nm的尾部。溫度、酸堿度的變化能夠影響噬菌體的生存和生產(chǎn)，作為一種生命體，噬菌體只有在活性良好的情況下才能夠發(fā)揮理想的殺菌作用。通過檢測噬菌體在不同溫度和pH值條件下的生存能力顯示，噬菌體Φ199在40~60℃范圍內(nèi)能夠保持較高的活性，在pH值3~12范圍具有較高的生物學(xué)活性，表明其能夠在較寬的溫度和酸堿環(huán)境下生存，證實該噬菌體具有良好的應(yīng)用前景。
由于抗生素的濫用，導(dǎo)致臨床上細(xì)菌耐藥性問題嚴(yán)重，且由于超級細(xì)菌的形成導(dǎo)致采用單一抗生素或抗菌藥物無法達(dá)到良好的治療效果，因此在臨床或試驗中常使用多種抗菌藥物聯(lián)合抗菌。目前已有較多的研究報告顯示，與單一噬菌體或抗生素相比，噬菌體與抗生素聯(lián)用具有協(xié)同作用，可以避免細(xì)菌感染或生物被膜的形成。此外，越來越多的臨床醫(yī)療者將噬菌體與抗生素聯(lián)合應(yīng)用以治療多重耐藥細(xì)菌感染引起的疾病，并且取得了較為顯著的治療效果。鹽酸克林霉素具有廣譜抗菌活性，主要通過與細(xì)菌核糖體的50S亞單位結(jié)合，抑制細(xì)菌肽鏈延長，從而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成。鹽酸克林霉素還可通過破壞細(xì)菌的表面結(jié)構(gòu)和抑制細(xì)菌的生物活性來殺傷細(xì)菌，并有利于吞噬細(xì)胞的吞噬。
本研究顯示，單獨使用鹽酸克林霉素時，鹽酸克林霉素對大腸桿菌的MIC為64μg/mL，抗菌效果較差。單獨使用噬菌體時，10^6~10^8 PFU/mL的噬菌體Φ199都無法在12 h內(nèi)抑制大腸桿菌O157:H7的生長。聯(lián)合用藥后結(jié)果顯示，在噬菌體濃度為10^6~10^7 PFU/mL時，能夠?qū)⒖股赜行褂脻舛冉抵?/2 MIC；在噬菌體濃度為10^8 PFU/mL時，能夠使抗生素的有效使用濃度降至1/4 MIC，表明聯(lián)合應(yīng)用可以協(xié)同或增加藥物的抗菌效果。有研究表明噬菌體與抗生素聯(lián)用能夠降低抗生素的使用濃度至1/2 MIC，而本試驗降低抗生素使用濃度至1/4 MIC，顯著提高了聯(lián)用效果。這種聯(lián)用效果的產(chǎn)生可能是由兩方面因素導(dǎo)致的：一方面是細(xì)菌可能因為遺傳限制使其無法高效產(chǎn)生2種抗菌機制的突變，并且抵抗不同抗菌機制之間可能存在相互負(fù)作用，即增強一種抵抗能力的同時會削弱另一種抵抗能力，且細(xì)菌莢膜對噬菌體的吸附十分重要，細(xì)菌可能通過丟失莢膜來改變噬菌體對其吸附能力，但是莢膜的丟失可能導(dǎo)致耐藥細(xì)菌對抗生素重新敏感；另一方面，抗生素和噬菌體協(xié)同作用可能迅速降低了細(xì)菌密度，從而降低了耐藥突變的概率。
綜上，本研究發(fā)現(xiàn)了一種能夠裂解大腸桿菌O157:H7的裂解性噬菌體Φ199，其與鹽酸克林霉素聯(lián)用后能夠在體外有效抑制細(xì)菌生長，表明這種聯(lián)用方法對于控制由耐藥性大腸桿菌O157:H7引起的感染具有潛在的應(yīng)用價值。然而，目前噬菌體與抗生素聯(lián)用的方法仍然存在一些需要解決的問題：一方面是噬菌體可能與抗菌劑之間存在拮抗作用，導(dǎo)致聯(lián)用后治療效果低于抗生素治療效果；另一方面是噬菌體與抗生素聯(lián)用仍然可能導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)毒素和毒性蛋白的釋放，造成機體損傷。本試驗沒有檢測噬菌體的耐藥基因，以及聯(lián)用后大腸桿菌O157:H7內(nèi)毒素、志賀毒素等毒素物質(zhì)的釋放。相關(guān)試驗表明，使用噬菌體和抗生素治療時能夠降低有毒物質(zhì)的釋放，提高對動物的治療效果，且能夠減少細(xì)菌耐藥性的發(fā)展。相信隨著研究的深入，以上問題將會得到解決，從而促進噬菌體-抗生素聯(lián)合應(yīng)用的發(fā)展和普及。
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