大黃魚(yú)病原性哈維氏弧菌在試驗(yàn)菌發(fā)酵上清液拮抗下的生長(zhǎng)曲線
本文用點(diǎn)種法定性初篩、酶標(biāo)法及牛津杯法定量復(fù)篩，從實(shí)驗(yàn)室保存的在海洋生物體中分離得到的未知海洋微生物中篩選對(duì)大黃魚(yú)病原性哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）具有較強(qiáng)拮抗作用的拮抗菌，并從抗菌譜、生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)、藥敏檢測(cè)、碳源利用等方面進(jìn)一步分析目的拮抗菌作為益生菌的特征，以期為大黃魚(yú)弧菌病防治及益生菌的開(kāi)發(fā)提供可參考的菌種。
生長(zhǎng)曲線繪制
根據(jù)酶標(biāo)儀所測(cè)OD630值繪制生長(zhǎng)曲線，選取生長(zhǎng)曲線上最陡的7個(gè)點(diǎn)做生長(zhǎng)曲線擬合度直線，直線斜率即為最大生長(zhǎng)率(μ)，直線在X軸上的截距為延滯生長(zhǎng)期(λ)，生長(zhǎng)曲線穩(wěn)定期切線在Y軸上的截距為最大生物量(A)。根據(jù)公式Td=ln2/μ求得倍增時(shí)間(Td)，根據(jù)公式RI/100=I/(λ×Td)，求得各菌株生長(zhǎng)參數(shù)(RI)。
拮抗菌的篩選
用點(diǎn)種法在實(shí)驗(yàn)室保存的65株未知的海洋微生物菌株中，獲得18株出現(xiàn)抑菌圈的初篩拮抗菌。酶標(biāo)法復(fù)篩，從生長(zhǎng)曲線對(duì)比圖1(a,b,c,d)可看出各試驗(yàn)菌的拮抗效果。在試驗(yàn)菌發(fā)酵上清液拮抗下的指示菌生長(zhǎng)曲線居于空白指示菌生長(zhǎng)曲線之下的均可能存在拮抗效果。因此，初步確定X15、Y13、Y26、Y36、Z10、X14、Z5、Z9、Y9、Z11、Y27、Z4、Y25、Y24、Z6、Z1具有對(duì)指示菌哈維氏弧菌的拮抗作用。
圖1指示菌在試驗(yàn)菌發(fā)酵上清液拮抗下的生長(zhǎng)曲線對(duì)比圖(a,b,c,d)
通過(guò)用牛津杯法直接測(cè)量抑菌圈直徑大小，并經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)分析，計(jì)算均值及標(biāo)準(zhǔn)誤差如表1所示，可間接得出酶標(biāo)法測(cè)得的16株試驗(yàn)拮抗菌對(duì)指示菌哈維氏弧菌的拮抗效果，從而確定最佳目的拮抗菌為X14菌株和X15菌株。
表1牛津杯法測(cè)得抑菌圈直徑（cm）
益生菌生長(zhǎng)曲線
如表2所示，列出了從兩株拮抗菌和兩株病原弧菌生長(zhǎng)曲線中推導(dǎo)得到的生長(zhǎng)參數(shù)，從中可看出兩拮抗菌最大生長(zhǎng)率較兩株病原菌大，但最大生物量較兩株病原菌小，延滯期也都較病原菌小，倍增時(shí)間都小于兩株病原菌。RI值較大的菌株具有短的延滯期和短的倍增時(shí)間，具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。兩株拮抗菌在相同的條件下可能較兩株病原菌更具生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，且X14生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)強(qiáng)于X15。
表2兩株拮抗菌和兩株病原弧菌生長(zhǎng)曲線參數(shù)
結(jié)論
用點(diǎn)種法定性初篩、酶標(biāo)法和牛津杯法定量復(fù)篩，從海洋生物體上獲得的65株菌中篩選出2株具有較高抗病原哈維氏弧菌的菌株X14、X15為目的拮抗菌。在對(duì)兩株益生菌特征分析的研究中，抗菌譜及生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示菌株X14、X15具有較廣的抗菌性，且兩株拮抗菌在相同的條件下可能較兩株病原菌更具生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌株對(duì)四環(huán)素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、氨芐西林、頭孢噻肟、復(fù)方新諾明、頭孢噻吩、利福平、萘啶酸、阿莫西林等10種藥物敏感。16S rDNA基因同源性分析的結(jié)果顯示與X14、X15同源性達(dá)99%以上的菌株均來(lái)自鏈霉菌屬（Streptomyces），進(jìn)一步建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示菌株X15與灰平鏈霉菌（Streptomyces griseoplanus）相似性最高，但結(jié)合形態(tài)特征及理化性質(zhì)不能將兩菌株確定到種。篩選得到的菌株X14、X15在拮抗病原哈維氏弧菌、抗菌譜、生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)及藥敏性等方面均初步滿足益生菌的篩選條件。
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