雞印第安納株沙門菌生長、致病性及藥物敏感性研究（一）
沙門菌屬(Salmonella)隸屬腸桿菌科(Enter?obacteriaceae)，擁有2 600多個血清型，是世界范圍內(nèi)造成人類和動物感染最頻繁的人畜共患病原菌之一。禽類是沙門菌的天然宿主，其中危害雞健康的主要血清型包括雞白痢、雞傷寒、腸炎、鼠傷寒、印第安納等，沙門菌可同時通過水平和垂直方式在雞群中進(jìn)行傳播。沙門菌不僅可以造成雞的感染發(fā)病，給養(yǎng)雞產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還可以通過肉蛋產(chǎn)品傳染給人類，持續(xù)地威脅食品和公共衛(wèi)生安全。
目前，沙門菌在國內(nèi)雞群中的流行形勢依然復(fù)雜嚴(yán)峻。Song等在國內(nèi)9個省17個家禽養(yǎng)殖場調(diào)查發(fā)現(xiàn)，主要流行雞白痢、腸炎和阿哥納沙門菌，其中也分離到印第安納沙門菌。對江蘇某企業(yè)肉雞產(chǎn)業(yè)鏈調(diào)查發(fā)現(xiàn)，印第安納沙門菌和腸炎沙門菌為優(yōu)勢血清型，并且攜帶多種毒力島基因。
針對廣東、廣西、福建和上海地區(qū)零售雞肉源沙門菌血清型調(diào)查研究表明，腸炎、鼠傷寒、印第安納、湯卜遜沙門菌較常見。本研究團(tuán)隊對安徽地區(qū)雞源沙門菌流行特征的研究顯示，安徽地區(qū)以腸炎、鼠傷寒和雞白痢沙門菌為優(yōu)勢血清型，其中也分離到8株印第安納沙門菌。
以上研究表明印第安納血清型沙門菌是國內(nèi)雞群及其雞肉加工和銷售產(chǎn)業(yè)鏈中較常見的流行血清型。細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生給家禽細(xì)菌性疫病的防治帶來不利影響。研究發(fā)現(xiàn)，從雞群中分離的沙門菌多重耐藥性比例達(dá)到70%左右，其中對青霉素類、四環(huán)素類、氯霉素和磺胺類抗生素表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性，而對氨基糖苷類和喹諾酮類的耐藥性較弱。
安徽地區(qū)雞源沙門菌顯示出對青霉素類、四環(huán)素類和磺胺類抗生素的高耐藥率，其中43.52%的菌株為多重耐藥菌株并且具有復(fù)雜的抗生素耐藥譜。
本研究從安徽省肥東縣一養(yǎng)雞場發(fā)病雞病變組織中分離到1株印第安納株沙門菌，對該分離株進(jìn)行了生長、致病性、耐藥性等相關(guān)特性的研究，并通過全基因組序列分析挖掘該菌株的毒力和耐藥基因攜帶情況，以期為雞場沙門菌病臨床治療提供指導(dǎo)，也為深入研究沙門菌致病和耐藥的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1病料
病料來自安徽省肥東縣一土雞養(yǎng)殖場，該養(yǎng)殖場為林地散養(yǎng)模式，發(fā)病雞群為72日齡。將2只發(fā)病雞送至安徽省農(nóng)科院獸醫(yī)臨床指導(dǎo)中心進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)其中1只病雞肝臟呈現(xiàn)典型的古銅色病變，疑似存在沙門菌感染。
1.2主要材料
SPF雞胚購自濟(jì)南鑫盛達(dá)生物工程有限公司，由本研究室進(jìn)行孵化和雛雞飼養(yǎng)。緩沖蛋白胨水(PBW)、氯化鎂孔雀綠增菌液(MM)和木糖賴氨酸培養(yǎng)基(XLT4)均購自青島海博生物技術(shù)有限責(zé)任公司。2×PCR Premix、DL2000 DNA Marker、細(xì)菌基因組提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司。氨芐西林、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢噻肟、頭孢曲松、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、新霉素、大觀霉素、慶大霉素、阿米卡星、多西環(huán)素、四環(huán)素、氯霉素、氟苯尼考、復(fù)方新諾明、甲氧芐啶、阿奇霉素、呋喃唑酮、亞胺培南、氨曲南和多黏菌素B共23種Kirby-Bauer藥敏紙片均購自杭州微生物試劑有限公司。
1.3細(xì)菌的分離鑒定
無菌采集2只病雞肝臟樣本作為細(xì)菌分離材料，接種到PBW進(jìn)行預(yù)增菌培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)12 h，而后轉(zhuǎn)接到MM選擇性增菌液中42℃培養(yǎng)16 h。在無菌條件下劃線接種到XLT4培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16 h。挑選中心呈黑色的疑似菌落接種到LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h。取菌液2 mL，12 000 r/min離心5 min，收集菌體，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌全基因組。利用16S rRNA基因通用引物進(jìn)行PCR鑒定菌屬，引物序列為27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC?·16AG-3′，1492R:5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系25μL:PCR Premix 12.5μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)至25μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共32個循環(huán);72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序。
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