3株奧默柯達酵母生長曲線、pH耐受性、最適生長溫度測定及對醬油香氣和滋味影響（三）
2.2 K.ohmeri的菌種性能
2.2.1不同鹽濃度下生長曲線
高鹽稀態醬油發酵鹽質量濃度一般≥160 g/L，而減鹽發酵醬油的鹽質量濃度則為100~120 g/L，為考察菌株在不同醬油生產中的生長特性，采取100 g/L和160 g/L鹽質量濃度的豆芽汁培養3株K.ohmeri，結果如圖4所示。3株菌在相同鹽濃度下的生長曲線類似，100 g/L鹽質量濃度下，3株菌對數期為16~44 h，44 h以后進入穩定期；而160 g/L鹽質量濃度下，3株菌的對數期則延至36~64 h，64 h以后到達穩定期。160 g/L鹽質量濃度下，3株酵母穩定期的ΔOD???的平均值為4.135，表明其在高鹽環境下生長情況良好。
2.2.2最適生長溫度及pH值
溫度是微生物生長的重要影響因素之一，最適生長溫度有利于獲得更多的發酵菌株。對3株酵母在24~40℃的生長情況進行測定，結果如圖5所示。3株菌在2種鹽濃度下發酵液的OD???值隨溫度的升高呈現先升后降的趨勢，30℃時OD值最大，因此30℃是3株菌的最適生長溫度。溫度升至40℃時，160 g/L鹽質量濃度的條件下，3株菌發酵液OD???值接近0，表明酵母在該條件下幾乎不生長。
高鹽稀態醬油釀造過程中，醬醪醪pH值一般為4~6。采用初始pH值為1~10的培養基對3株酵母生長情況進行測定，結果如圖6所示。100 g/L鹽質量濃度下，pH值為3~9時，3株酵母都有一定的生長能力；pH值為4~6時，生長能力最好；而在pH值為1~2及10的條件下不可生長。160 g/L鹽質量濃度下，3株酵母在相同pH值條件下的OD???值均低于100 g/L鹽質量濃度，pH值為3~8時都有一定生長，其中pH值為4~6時，生長能力最好，pH值為1~2及9~10的條件下不可生長。
2.2.3高鹽下產乙醇能力及揮發性風味物質代謝能力
對3株酵母160 g/L鹽質量濃度下的產乙醇能力進行測定，結果如圖7-a所示。3株酵母豆芽汁發酵液中的乙醇體積分數均高于0.5%，其中KD13最高，達到0.573%。進一步分析豆芽汁發酵液揮發性風味物質，發現發酵液中存在多種香氣成分，其中KD13發酵液總揮發性風味物質含量最高，為（997.54±88.15）μg/L（圖7-b）。綜合以上K.ohmeri發酵性能特點，選用KD13進行后續的添加發酵應用。
2.3添加K.ohmeri KD13對醬油發酵的影響
2.3.1醬油的4個重要理化指標：還原糖、總酸、氨態氮、乙醇含量變化如圖8所示。醬油發酵過程中還原糖含量逐漸降低，總酸含量逐漸上升，氨態氮含量在發酵后期趨于穩定。添加KD13的醬油乙醇體積分數在發酵90 d時為2.34%，較對照組提升11.4%，表明KD13具有提升醬油乙醇含量的能力。
2.3.2添加KD13對醬油揮發性風味物質的影響
為了研究添加KD13對醬油香氣的影響，利用SPME-GC-MS的方法對發酵45、60、75、90 d的添加KD13和未添加KD13的2組醬油共計8個樣品中的揮發性風味物質種類及含量進行分析鑒定。如表2所示，共檢測到60種香氣成分，其中酯類化合物12種、醇類化合物19種、醛類化合物8種、酮類化合物5種、酸類化合物5種、酚類化合物5種、雜環類化合物6種。KD13組揮發性風味物質總含量為（3912.70±253.18）μg/L，比對照組高22.18%，其中KD13組揮發性酯類物質總含量為（383.06±26.90）μg/L，比對照組高97.62%，酚類物質總含量為（201.32±10.93）μg/L，比對照組高70.18%。
以表2中60種香氣成分作為因變量,不同發酵時間的2組醬油作為自變量進行OPLS-DA分析,并計算預測變量重要性投影(variable importance inprojection)。VIP值越大,因變量對樣品區分度的貢獻值就越大,若VIP值>1表明為關鍵因變量。
如圖9-a所示,共篩選到23種VIP值>1的差異風味物質。其中酯類4種、醇類物質10種、酚類物質2種、醛類物質3種、其他類4種。對上述23種物質進行熱圖分析,由圖9-b可以看出,KD13組多種香氣物質含量比CK組多,其中包括酯類物質中的乳酸乙酯(奶油香)、辛酸乙酯(酒香)、乙酸異戊酯(花香)、乙酸異丁酯(花香);醇類物質中的乙醇(醇香)、正丁醇(葡萄酒香)、苯甲醇(花香);醛類物質中的苯乙醛(果香)、3-甲硫基丙醛(醬香);酚類物質中的4-乙基愈創木酚(煙熏香);雜環類物質中的2-乙基-6甲基吡嗪(可可香)、2,6-二甲基吡嗪(堅果香)、2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮(焦糖香)。以上分析表明,KD13不僅對醬油中乙醇含量有提升作用,同時對乙酯類等多種醬油特征風味物質有增益作用。
2.3.3添加KD13對醬油揮發性風味物質的影響
以表2中60種香氣成分作為因變量，不同發酵時間的2組醬油作為自變量進行OPLS-DA分析，并計算預測變量重要性投影（variable importance in projection,VIP）。VIP值越大，因變量對樣品區分度的貢獻值就越大，若VIP值>1表明為關鍵因變量。如圖9-a所示，共篩選到23種VIP值>1的差異風味物質。其中酯類4種、醇類物質10種、酚類物質2種、醛類物質3種、其他類4種。對上述23種物質進行熱圖分析，由圖9-b可以看出，KD13組多種香氣物質含量比CK組多，其中包括酯類物質中的乳酸乙酯（奶油香）、辛酸乙酯（酒香）、乙酸異戊酯（花香）、乙酸異丁酯（花香）；醇類物質中的乙醇（醇香）、正丁醇（葡萄酒香）、苯甲醇（花香）；醛類物質中的苯乙醛（果香）、3-甲硫基丙醛（醬香）；酚類物質中的4-乙基愈創木酚（煙熏香）；雜環類物質中的2-乙基-6-甲基吡嗪（可可香）、2,6-二甲基吡嗪（堅果香）、2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮（焦糖香）。以上分析表明，KD13不僅對醬油中乙醇含量有提升作用，同時對乙酯類等多種醬油特征風味物質有增益作用。
2.3.4感官評價分析
醬油的感官評價可以從色澤、體態、滋味、香氣4個方面進行評估。對照組及KD13組醬油的感官評分結果如圖10所示。2組醬油的色澤和體態評分較為接近，而KD13組滋味評分高于對照組，可能是由于酵母菌體在后酵后期發生自溶，產生呈鮮味的核酸類物質。另外KD13組的香氣評分也高于對照組，這和2.3.2節的研究結果一致。感官評價結果表明，添加KD13對醬油色澤體態無負面影響，并且對醬油的滋味和香氣有提升作用。
3結論
本研究從華中地區發酵3~4月的高鹽稀態醬醪醪中分離篩選得到了10株K.ohmeri，10株菌均為溶血安全性菌株。對其中3株產乙醇能力較強的菌株進行菌種性能研究，發現3株菌在160 g/L鹽質量濃度、溫度為24~38℃、pH值4~6的環境下均生長良好，總體性能差異不大。由于在鹽濃度為160 g/L的條件下，菌株KD13的乙醇及揮發性風味物質代謝能力最強，因此進一步將其添加到高鹽稀態醬醪醪中發酵，發現KD13對醬油中的乙醇體積分數有提升作用，并且對醬油中多種乙酯類香氣物質如乳酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯及一些醬油特征風味化合物如4-乙基愈創木酚、3-甲硫基丙醛等有增益作用。感官評價結果顯示，添加KD13對醬油的色澤、體態無負面影響，對醬油的滋味和香氣及總體評分有提升作用。綜上所述，本研究分離篩選的耐鹽K.ohmeri具有作為新型風味菌強化醬油發酵、提升風味的潛力。然而本研究中僅探究了K.ohmeri單一菌種添加發酵對醬油的影響，未來需進一步探明與其他優勢風味菌的交互作用。