巨大芽孢桿菌BM24生長曲線、耐藥性、益生潛力評估及藥敏試驗（四）
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3.1羊源巨大芽孢桿菌BM24體外益生潛力
宿主和腸道菌群之間存在著特異性相互選擇關(guān)系，動物腸道內(nèi)的微生物更易在本體動物內(nèi)繁殖和定植。因此，理想的羊用益生菌株應該來自健康羊的胃腸道。本研究從健康新疆細毛羊新鮮糞便中分離得到1株巨大芽孢桿菌，命名為巨大芽孢桿菌BM24，并對其進行體外益生潛力和小鼠體內(nèi)安全性評價，以為今后養(yǎng)羊業(yè)羊源益生菌的應用提供參考。
良好的益生菌特性是:耐酸耐膽鹽、無溶血活性、抗生素敏感性、抗有害微生物活性。益生菌在宿主腸道定植并發(fā)揮作用，候選菌株需要對胃的酸性和腸道的膽汁鹽具有一定的耐受性，動物胃液的pH通常在3.0左右，羊腸道中的膽鹽濃度在0.03%~0.30%。有研究發(fā)現(xiàn)，來源于綿羊乳制品中的植物乳桿菌對低pH及高濃度膽鹽有較好的耐受性;田亮金等研究表明，在人工胃液和腸液的作用下，巨大芽孢桿菌A20、A27、B47和B89的存活率均可高于60%。本試驗分離出的羊源巨大芽孢桿菌BM24在pH為3.0時存活率為73.63%，pH為1.0時仍有28.28%的存活率，表明其具有良好的耐酸能力;同時，該菌株能夠在0.1%~0.3%膽鹽下存活，有較好的膽鹽耐受性，與不同種屬的芽孢桿菌耐膽鹽特性相似，表明羊源巨大芽孢桿菌BM24能夠耐受胃腸道環(huán)境。
益生菌具有在腸道中轉(zhuǎn)移抗生素抗性基因至病原菌中的潛在能力，因此候選益生菌在應用前必須進行抗生素耐藥性評估。本研究使用15種常見抗生素對羊源巨大芽孢桿菌BM24進行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)其對其中12種抗生素表現(xiàn)出高度敏感，表明該菌株的耐藥性低，安全性高。有研究發(fā)現(xiàn)，羊源地衣芽孢桿菌對萬古霉素、慶大霉素和四環(huán)素等抗生素敏感;徐淑琴等發(fā)現(xiàn)，來源于藏羊瘤胃液中的1株沙福芽孢桿菌對青霉素類、氨基糖苷類及多肽類等抗生素表現(xiàn)出敏感性;陳永亮等從散養(yǎng)草雞內(nèi)臟中分離出的1株巨大芽孢桿菌201706J對諾氧沙星、環(huán)丙沙星、卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素等常用抗生素均敏感，與本試驗結(jié)果一致。候選益生菌是否有溶血性是評估菌株益生潛力的重要條件之一，本研究分離得到的羊源巨大芽孢桿菌BM24不具有溶血活性，與周海歐等的研究結(jié)果相一致。
已有研究表明，芽孢桿菌可通過分泌細菌素、磷脂類、抗菌肽等抗菌物質(zhì)，破壞病原菌的細胞壁和細胞膜，抑制病原菌的生長。Rajput等研究發(fā)現(xiàn)，從羊奶中分離到的腸球菌具有抑制金黃色葡萄球菌、沙門氏菌及銅綠假單胞菌生長的作用。來源于育肥綿羊空腸的海氏腸球菌對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌具有一定的抑制效果。巨大芽孢桿菌L2發(fā)酵產(chǎn)物LE4-3可抑制胡蘿卜軟腐歐文氏菌EC-1生長。菌株L2粗提物LE4-5對2種食品植物病原菌株青枯雷爾氏菌RS-2和根癌農(nóng)桿菌T-37的生長均有較好的抑制效果。有研究發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌JX-1對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有很強的抑制效果，巨大芽孢桿菌N17-12對副傷寒沙門氏菌和大腸桿菌有明顯的抑制作用。巨大芽孢桿菌MIT411對大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌以及空腸彎曲桿菌有良好的抗菌活性。在本研究中，羊源巨大芽孢桿菌BM24對常見腹瀉致病菌大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出良好的抑制能力。
益生菌進入腸道后，通常需要快速定植并迅速生長，從而在微生物競爭中獲得優(yōu)勢，成為優(yōu)勢菌群。趙龍妹等研究發(fā)現(xiàn)，巨大芽孢桿菌XT2在2~10 h進入對數(shù)生長期，菌體增殖迅速，10~20 h進入生長穩(wěn)定期。本研究分離得到的羊源巨大芽孢桿菌BM24在2~6 h即可進入對數(shù)生長期，表明其具有良好的生長特性。
3.2羊源巨大芽孢桿菌BM24體內(nèi)安全性
潛在益生菌株在投入生產(chǎn)前需要進行體內(nèi)安全性評價，急性口服毒性試驗是評價益生菌是否安全的最基本安全性評估試驗。鐘羅華等研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)口服巨大芽孢桿菌液1周，整個試驗期間小鼠無死亡及腹瀉，且巨大芽孢桿菌組小鼠體重有明顯的增加。在其他潛在益生菌株體內(nèi)安全性研究中，白海等以小鼠為動物模型評估了枯草芽孢桿菌的安全性。Abid等從牛奶中分離發(fā)酵乳桿菌而后通過21 d連續(xù)灌胃小鼠證明其是安全無毒的。張楠馳等采用高濃度菌懸液灌胃小鼠的方法評價羊源解淀粉芽孢桿菌fsznc-06的安全性，結(jié)果表明該菌對小鼠未造成負面影響。向微微等通過對小鼠進行經(jīng)口灌胃及腹腔注射試驗發(fā)現(xiàn)羊源彎曲乳桿菌Y15具有良好的安全性。Hou等發(fā)現(xiàn)，綿羊源地衣芽孢桿菌B63對昆明小鼠及SD大鼠無毒副作用。本試驗中，腹腔注射羊源巨大芽孢桿菌BM24后的7 d觀察期間，小鼠的生理狀態(tài)均正常，無發(fā)病和死亡，解剖后小鼠體內(nèi)臟器眼觀均無異常癥狀，表明羊源巨大芽孢桿菌BM24無急性致病性;經(jīng)過連續(xù)14 d的灌胃羊源巨大芽孢桿菌BM24，發(fā)現(xiàn)所有小鼠的飲水、采食、糞便及活動均正常，無小鼠死亡;灌胃試驗結(jié)束后，試驗組與對照組相比，小鼠體重、血細胞指標均無顯著差異，肝臟、脾臟、腎臟均未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化，且2組小鼠臟器指數(shù)無顯著差異。綜上所述，本試驗分離得到的菌株羊源巨大芽孢桿菌BM24對小鼠無毒副作用，作為益生菌來使用是安全的。
4結(jié)論
本研究從健康細毛羊糞便中分離的巨大芽孢桿菌BM24不僅在體外表現(xiàn)出對酸和膽鹽良好的耐受性，對多種常見抗生素敏感，對沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長具有抑制作用，不具有溶血活性，生長速度快，而且在小鼠體內(nèi)通過灌胃和腹腔注射試驗證明了其具有良好的安全性，可作為羊源益生菌菌株今后在養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)中使用。
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