生食大眼金槍魚中生物胺產(chǎn)生菌分離純化、菌落總數(shù)、生長曲線及形狀鑒定（三）
2.4生物胺生成情況分析
為進(jìn)一步確認(rèn)這9株菌的產(chǎn)胺能力，將9株菌株分別接種到TSB培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)3 d，分析培養(yǎng)液中生物胺產(chǎn)生質(zhì)量濃度，結(jié)果如表2所示。由表2可知，9株菌均可產(chǎn)生色胺、腐胺和尸胺，菌株B-9生物胺生成能力較其他菌株最弱，總質(zhì)量濃度為2.78 mg/L。B-1、B-3和B-7的產(chǎn)胺能力較強(qiáng)，總生物胺質(zhì)量濃度分別為40.4、41.3和50.3 mg/L。其中B-1的色胺產(chǎn)生質(zhì)量濃度最高，為38.9 mg/L；B-3亞精胺產(chǎn)生質(zhì)量濃度最高，為31.2 mg/L；B-7酪胺產(chǎn)生質(zhì)量濃度最高，為38.5 mg/L。
表2菌株的生物胺生成情況
a-9株菌株在0℃下的生長曲線;b-9株菌株在30℃下的生長曲線
圖2九株菌株在0℃和30℃下的生長曲線
2.5生物胺產(chǎn)生菌的形態(tài)特征
將3株產(chǎn)胺量最高的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察。從顯微鏡下觀察到B-1為革蘭氏陰性菌，菌落形態(tài)為乳黃色圓形凸起菌落，邊緣整齊，菌株為球狀菌，無芽孢。B-3為革蘭氏陰性菌，菌落形態(tài)為圓形，表面光滑不透明，乳黃色，邊緣整齊，菌株為桿狀菌，無芽孢。B-7為革蘭氏陽性菌，菌落形態(tài)為白色凸起，邊緣整齊，表面光滑圓潤，菌株為球狀菌，無芽孢。
2.6生物胺產(chǎn)生菌的鑒定
2.6.1生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定
VITEK 2鑒菌儀是通過將檢測菌株的各項(xiàng)生理生化實(shí)驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果與已知的菌株數(shù)據(jù)庫作比較，從而推測菌株的可能性概率，可信概率范圍為85.0%～99.0%。經(jīng)鑒定，3株菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。鑒定B-1菌株為巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus)，可信概率為99.0%；B-3菌株為產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)，可信概率為97.0%；B-7菌株為糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)，可信概率為99.0%。
表3菌株鑒定結(jié)果
2.6.2 16S rDNA鑒定
瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物圖片結(jié)果如圖3所示，電泳可成功擴(kuò)增出預(yù)期的DNA片段，且2 000 bp處擴(kuò)增條帶清晰明亮，所以該P(yáng)CR片段可同時作為后續(xù)PCR反應(yīng)中的引物和模板，送檢測序。
圖3三株菌株的瓊脂糖凝膠電泳圖
將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，并建立系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖4所示。從比對結(jié)果可知，樣本B-1與溶酪巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus)親源關(guān)系最近，樣本B-3與產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)親源關(guān)系最近，樣本B-7與糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)親源關(guān)系最近。由于溶酪巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus)為細(xì)菌致病菌，可引起一些水產(chǎn)動物大量死亡，推斷B-1來自外界環(huán)境，并隨著貯藏時間的增加，逐漸成為金槍魚腐敗菌中的優(yōu)勢菌種。產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)和糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)是人和動物腸道的正常菌群，但由于金槍魚體型較大，腸道污染可能性較小，因此推斷B-3與B-7同樣來自外界環(huán)境。
圖4基于16S rDNA序列構(gòu)建的進(jìn)化樹
3結(jié)論
本研究利用生物胺初篩培養(yǎng)基結(jié)合高效液相色譜技術(shù)，從大眼金槍魚生魚片中篩選出9株生物胺產(chǎn)生菌，其中3株產(chǎn)胺量最高的菌株分別為溶酪巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus)、產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)和糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)。溶酪巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus)和產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)均屬于新發(fā)現(xiàn)的生物胺產(chǎn)生菌。糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)曾被LADERO等從乳制品中分離得到。產(chǎn)堿普羅威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)能夠引起人體食物中毒、嚴(yán)重的腸胃炎、腹瀉等疾病，對人體健康有潛在的危險(xiǎn)性。
研究表明，根據(jù)產(chǎn)胺菌的生物學(xué)特性，可通過抑制相關(guān)菌群和低溫貯藏相結(jié)合的方法來控制生物胺的生成，保證大眼金槍魚的品質(zhì)和食用安全性。
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