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巨大芽孢桿菌BM24生長曲線、耐藥性、益生潛力評估及藥敏試驗(二)

來源:動物營養(yǎng)學報 發(fā)布時間:2025-03-12 16:20:05 瀏覽:128 次

1.2試驗方法


1.2.1芽孢桿菌分離


取新鮮糞便放入無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中,渦旋混勻,水浴鍋80℃加熱處理20 min,靜置后取100μL上清液接種于LB肉湯中,37℃下恒溫培育18 h,梯度稀釋,取10-4、10-5和10-6稀釋度的菌液于LB瓊脂平板上涂布,倒置培養(yǎng)。挑出不同形態(tài)的單菌落,接種純化3代,直至平板上的菌落形狀、大小、顏色一致,采用革蘭氏染色與芽孢染色法觀察形態(tài),鏡檢篩選出形態(tài)呈桿狀且有內(nèi)生孢子的菌株,將其菌液與60%滅菌甘油等體積混合,于-80℃凍存?zhèn)溆谩?


1.2.2分離菌株生化鑒定


使用HBI芽孢桿菌生化鑒定條對分離菌株進行生化反應(yīng)鑒定,鑒定結(jié)果與《伯杰氏系統(tǒng)細菌手冊》比對。


1.2.3分離菌株16S rRNA基因序列分析


參考水煮法提取細菌DNA作為PCR擴增模板,細菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')用于PCR擴增鑒定,引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。擴增體系:Premix Taq 10μL,上、下游引物各0.5μL,基因組DNA 5μL,ddH2O 4μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預變性3 min;95℃變性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸30 s,共30個循環(huán);72℃延伸5 min;擴增產(chǎn)物4℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物,將PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序分析,測序結(jié)果上傳于NCBI網(wǎng)站進行序列比對,分析其種屬。


1.2.4分離菌株的益生潛力評估


1.2.4.1耐酸性


調(diào)整LB肉湯的pH分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0,滅菌后備用。將凍存的分離菌株接種至LB肉湯,37℃、180 r/min搖床過夜培養(yǎng),按1%的接種量接入不同pH的LB肉湯中,37℃搖床培養(yǎng)4 h后吸取200μL菌懸液至酶標板中,于酶標儀檢測其在600 nm處的吸光度(OD600)值,以LB肉湯(pH 7.0)為對照,測量樣品分為3份,每份重復測定3次,計算菌株相對存活率。


相對存活率(%)=(試驗組OD600值/對照組OD600值)×100。


1.2.4.2耐膽鹽


配制分別含有0.1%、0.2%、0.3%膽鹽的LB肉湯備用。將凍存的分離菌株接種至LB肉湯,37℃、180 r/min搖床過夜培養(yǎng),按1%的接種量接入不同膽鹽濃度的LB肉湯中,37℃搖床培養(yǎng)4 h后吸取200μL菌懸液至酶標板中,于酶標儀檢測其OD600值,以不添加膽鹽的LB肉湯為對照,測量樣品分為3份,每份重復測定3次,按照1.2.4.1中公式計算菌株相對存活率。


1.2.4.3藥敏試驗


采用紙片擴散法(K-B法)測定分離菌株對青霉素G、萬古霉素、鏈霉素等15種抗菌藥物的抗生素敏感性。取100μL過夜培養(yǎng)的菌懸液均勻涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基上,再將所選藥敏片貼在培養(yǎng)基表面,并輕輕壓實,于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng),通過測量藥敏片周圍抑菌圈直徑大小來判斷菌株的藥物敏感性。結(jié)果判定參照《紙片法抗菌藥物敏感試驗標準》(WS/T 125-1999)。


1.2.4.4溶血活性


使用無菌脫纖維綿羊血制備綿羊血平板備用。分離菌株活化后在綿羊血平板上劃線,于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng),觀察菌落周圍是否出現(xiàn)溶血環(huán)。


1.2.4.5抗菌活性


采用牛津杯法測定分離菌株的抗菌活性。將病原菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌)均勻涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基,將牛津杯放置于LB瓊脂平板上,輕輕按壓,在牛津杯中加入200μL(108 CFU/mL)分離菌株的菌懸液,37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng),測定抑菌圈直徑。


1.2.5生長曲線


取過夜培養(yǎng)的菌懸液,按1%的接種量接入LB肉湯中,37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,每隔2 h取菌懸液1次,共取12次,以無菌LB肉湯為對照,利用微生物生長曲線分析儀測定OD600值,重復測定3次,繪制生長曲線。


1.2.6體內(nèi)安全性


參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部制定的《直接飼喂微生物和發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株鑒定及其安全性評價指南》對分離菌株進行安全性評估。


1.2.6.1灌胃


10只小鼠適應(yīng)環(huán)境7 d后隨機分為2組,對照組灌胃生理鹽水(0.2 mL/只),試驗組灌胃活菌數(shù)為108 CFU/mL的分離菌株(0.2 mL/只),持續(xù)灌胃14 d。小鼠自由采食和飲水。每日灌胃前記錄小鼠的體重變化,同時觀察小鼠毛色、整體精神狀態(tài)及分泌物、排泄物狀況。灌胃結(jié)束后,采集小鼠血液,進行血細胞指標分析;將小鼠安樂死后取肝臟、脾臟、腎臟,無塵紙擦干表面水分后稱重,計算臟器指數(shù)。


臟器指數(shù)(%)=[臟器重(g)/體重(g)]×100。


1.2.6.2腹腔注射


10只小鼠適應(yīng)環(huán)境7 d后隨機分為2組,對照組腹腔注射生理鹽水(0.2 mL/只),試驗組腹腔注射活菌數(shù)為108 CFU/mL的分離菌株(0.2 mL/只),小鼠自由采食和飲水,僅在第1天注射,觀察小鼠毛色、整體精神狀態(tài)及分泌物、排泄物狀況,連續(xù)觀察7 d。7 d后將小鼠安樂死,解剖觀察各組織器官是否存在病理變化。


1.3數(shù)據(jù)處理與分析


試驗數(shù)據(jù)用SPSS 26.0進行t檢驗,GraphPad Prism 8作圖,數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標準差。P<0.05表示差異顯著,P>0.05表示差異不顯著。


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