雞印第安納株沙門(mén)菌生長(zhǎng)、致病性及藥物敏感性研究（二）
1.4生長(zhǎng)曲線測(cè)定
將分離的菌株接種到LB培養(yǎng)基中，于37℃搖床振蕩培養(yǎng)，采用全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)測(cè)定菌液600 nm的吸光值(OD600)，當(dāng)OD600值達(dá)到1時(shí)，將菌液按1∶100進(jìn)行稀釋后，接種到新鮮的LB培養(yǎng)基中120 r/min搖床培養(yǎng)，每隔1 h取出，測(cè)定OD600值，連續(xù)測(cè)16 h，繪制菌液吸光度曲線;分別在1、2、4、8、10、12、14、16 h吸取培養(yǎng)菌液，用LB肉湯進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)⒔臃N在LB平板上，37℃培養(yǎng)16 h，計(jì)數(shù)菌落，繪制活菌數(shù)變化曲線。
1.5毒力測(cè)定
將分離鑒定后的菌株接入LB液體培養(yǎng)基，37℃200 r/min培養(yǎng)12 h獲得菌液。將菌液離心，收集菌體，使用生理鹽水清洗菌體2次后備用。將30只3日齡SPF雛雞隨機(jī)分為5組，每組6只。第1~5組雛雞肌肉注射菌液，接種劑量依次為1.50×107、1.50×106、1.50×105、1.50×104、1.50×103 CFU，對(duì)照組雛雞接種等量生理鹽水，觀察7 d內(nèi)雛雞發(fā)病及死亡情況，并計(jì)算分離菌半數(shù)致死量(LD50)。在接種后第3天，對(duì)3只病死雛雞和2只健康雛雞進(jìn)行解剖檢查，觀察組織器官病變情況。
1.6耐藥性檢測(cè)
取分離菌株接種于LB培養(yǎng)基，于37℃搖床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。用無(wú)菌生理鹽水將菌液稀釋至0.5麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)。取滅菌棉簽蘸取菌液均勻地涂布于MH瓊脂平板。按WHO提供的Kindy-Bauer操作方法將藥敏紙片貼在涂布細(xì)菌的MH瓊脂平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，測(cè)量抑菌圈的直徑，按照藥敏紙片說(shuō)明書(shū)進(jìn)行藥物敏感性判定。
1.7全基因組測(cè)序分析
分離菌株的全基因組測(cè)序委托上海凌恩生物科技有限公司完成，測(cè)序過(guò)程按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。提取高質(zhì)量細(xì)菌DNA并進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，采用PacBio平臺(tái)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)、文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)和文庫(kù)測(cè)序，使用Unicycler v0.4.8以默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行基因組組裝，并通過(guò)Circlator v1.5.5軟件構(gòu)建菌株完成圖。細(xì)菌基因模型使用GeneMarkv4.17進(jìn)行識(shí)別。將所有基因模型與NR、eggNOG、SwissProt、KEGG、COG數(shù)據(jù)庫(kù)模塊進(jìn)行比對(duì)，完成基因功能注釋。利用綜合的抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)CARD發(fā)掘分離株的耐藥基因。采用毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)VFDB比對(duì)菌株的毒力因子。使用SeqSero 1.2數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)菌株進(jìn)行血清型分析，PlasmidFinder 2.1分析質(zhì)粒類(lèi)型;采用IECfinder預(yù)測(cè)基因組的可移動(dòng)元件。
1.8比較基因組學(xué)分析
以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中6株國(guó)內(nèi)分離的雞源印第安納沙門(mén)菌基因組作為參考基因組，與測(cè)序獲得的分離株SM24全基因序列進(jìn)行比較分析，6株參考菌株的信息見(jiàn)表1。
采用序列比對(duì)軟件MUMmer鑒定菌株的同源基因，并使用CD-HIT快速聚類(lèi)分析對(duì)菌株基因組Core/Pan基因進(jìn)行聚類(lèi)，鑒定菌株共有和特有基因。利用MUSCLE軟件進(jìn)行菌株Core基因多序列比對(duì)，并使用PhyML軟件中的最大似然法(ML法)構(gòu)建菌株進(jìn)化樹(shù)。
表1參考菌株信息
2結(jié)果與分析
2.1沙門(mén)菌分離與鑒定
發(fā)病雞病料經(jīng)PBW預(yù)增菌和MM培養(yǎng)基的選擇性增菌，接種至XLT4選擇性平板上，37℃培養(yǎng)24 h，其中1份樣品培養(yǎng)出圓形、邊緣整齊、呈灰白色，中心呈黑色、大小均一的單一菌落(圖1A)。經(jīng)革蘭染色，該菌被染成紅色，菌體呈短桿狀(圖1B)，初步判定該菌為革蘭陰性的沙門(mén)菌。提取細(xì)菌基因組，采用細(xì)菌通用16S rRNA引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得大小為1 500 bp左右的PCR產(chǎn)物(圖2)，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將16S rRNA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，其序列與沙門(mén)菌屬的同源性均高·26·Animal Husbandry&Veterinary Medicine 2025 Vol.57 No.4于99%，因而確定分離菌株為沙門(mén)菌，命名為SM24株。
圖1分離菌株在XLT4平板上的菌落形態(tài)(A)和革蘭染色鏡檢(B)(1 000×)M.DL2000 DNA Marker;1、2.16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物。
圖2分離菌株16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物
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