犬奇異變形桿菌及其噬菌體分離鑒定、生長曲線及藥敏試驗（三）
2.4噬菌斑及噬菌體電鏡觀察
以分離獲得的奇異變形桿菌PM-XNR為宿主菌，通過雙層瓊脂平板法從污水中分離出1株裂解性噬菌體，命名為vB_PmM_XNR（縮寫為XNR）。在雙層瓊脂平板上可見形狀規(guī)則、邊界清晰、透明的噬菌斑（圖1 A）。XNR經(jīng)負(fù)染后電鏡顯示（圖1 B），XNR頭部呈二十面體對稱，直徑約為60±3 nm，具有短尾。
2.5噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)及一步生長曲線
如表2所示，當(dāng)MOI=0.01時，噬菌體XNR感染宿主后噬菌體滴度增加了將近104；為XNR的最佳感染復(fù)數(shù)。
圖3 vB_PmM_XNR噬菌斑和電鏡圖片
表2 vB_PmM_XNR最佳感染復(fù)數(shù)
當(dāng)MOI=0.01時噬菌體產(chǎn)出量最高，按0.01的比例繪制一步生長曲線。XNR一步生長曲線如圖4所示。XNR感染宿主菌后15 min內(nèi)（潛伏期）滴度無明顯的變化，感染后15～55 min內(nèi)，噬菌體數(shù)量急劇增加，可知XNR爆發(fā)時間約為40 min，平均裂解量約為80 PFU·cell-（1裂解量=爆發(fā)末期噬菌體效價/感染初期宿主菌濃度）。
圖4 vB_PmM_XNR一步生長曲線測定
2.6噬菌體熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性及氯仿敏感性
噬菌體分離自污水中，對環(huán)境的適應(yīng)能力和耐受能力相對較強。溫度敏感性實驗結(jié)果（圖5 A）表明，噬菌體vB_PmM_XNR在4℃～42℃之間，活性基本穩(wěn)定。當(dāng)溫度升高到60℃時，噬菌體vB_PmM_XNR滴度下降100倍左右；達到70℃時，噬菌體全部失活。
從結(jié)果（圖5 B）可以看出噬菌體vB_PmM_XNR經(jīng)不同的pH處理1 h后，pH值為2.0和12.0時噬菌體失活；而pH值在6.0～8.0范圍內(nèi)時酸堿度對噬菌體的活性影響不大。上述表明，vB_PmM_XNR具有較好的熱穩(wěn)定性和耐酸堿性，能夠滿足后續(xù)動物體內(nèi)治療的需要。
圖5噬菌體vB_PmM_XNR的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性測定
由表3可知，氯仿對噬菌體效價無顯著影響，說明噬菌體vB_PmM_XNR粒子表面不含有脂類物質(zhì)，對氯仿不敏感。
表3噬菌體vB_PmM_XNR氯仿敏感性
2.7噬菌體對奇異變形桿菌的裂解作用
從圖6中可以看出，XNR對PM-XNR具有較好的裂解作用。XNR作用24 h后，細(xì)菌濃度下降3個數(shù)量級，由108CFU·mL-1降至105CFU·mL-（1清除效率約為99.9%）；而XNR效價從108PFU·mL-1增至109PFU·mL-1。PM-XNR濃度隨XNR作用時間延長不斷降低，XNR效價不斷增加，表明噬菌體XNR能夠持續(xù)有效抑制和清除細(xì)菌。
圖6噬菌體XNR對奇異變形桿菌的裂解作用
3討論與結(jié)論
近年來，奇異變形桿菌作為人獸共患的病原體，在人與動物中引起的感染頻繁發(fā)生。特別是能夠感染寵物的病原菌，奇異變形桿菌就是其中之一。寵物與人類接觸密切，增加了人類感染性疾病患病幾率，對人類健康造成一定的威脅，同時也受到了廣泛的關(guān)注。此外，廣譜抗生素的大量使用及濫用，導(dǎo)致臨床耐藥菌株的產(chǎn)生并且耐藥性不斷增加，這也為臨床治療帶來了較大的挑戰(zhàn)，成為嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)問題。從大慶市農(nóng)大動物醫(yī)院患犬尿液中分離到奇異變形桿菌，該菌株具有溶血活性和產(chǎn)脲酶分解尿素，說明該菌株具有致病性，與寵物出現(xiàn)的感染性結(jié)石癥狀相吻合。
前期研究表明，多數(shù)奇異變形桿菌對氨基糖苷類與β-內(nèi)酰胺類藥物敏感。林燕青等對2016～2018年奇異變形桿菌耐藥性進行研究，發(fā)現(xiàn)奇異變形桿菌對氨芐西林、頭孢唑林、復(fù)方新諾明、呋喃妥因的耐藥率均＞50%，并且氨芐西林/舒巴坦的耐藥率從29.8%上升到42.6%；對慶大霉素的耐藥率從35.1%降到27.9%。奇異變形桿菌對頭孢他啶、頭孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、阿米卡星的耐藥率均＜6%。楊睿等作用從腹瀉仔豬中分離的15株奇異變形桿菌均有多重耐藥性，其中13株含有3種以上的耐藥基因。結(jié)果表明，腹瀉仔豬中分離的奇異變形桿菌含有大量的耐藥基因和多重耐藥性，可以引起仔豬腹瀉癥狀，導(dǎo)致抗生素在臨床治療時不能發(fā)揮。試驗對分離的PM-XNR進行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)PM-XNR對大多數(shù)藥物耐藥或不敏感，僅對四代頭孢吡肟敏感，超出正常寵物的臨床用藥，說明分離自犬的奇異變形桿菌耐藥性極強，這可能與人類或?qū)櫸锟咕幬锏氖褂貌划?dāng)和濫用存在一定聯(lián)系。同時，有研究表明將動物源和人源奇異變形桿菌菌株進行了毒力基因、表型方面進行比較，未發(fā)現(xiàn)不同來源菌株的毒力特征有明顯的差異。說明犬源奇異變形桿菌對人類健康存在一定威脅。
噬菌體自發(fā)現(xiàn)之初便應(yīng)用于細(xì)菌性疾病的治療，并取得了良好的治療效果。由于廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，使噬菌體的研究逐漸被人們遺忘。1958年余賀利用噬菌體成功治愈了燒傷病人的綠膿桿菌感染，開創(chuàng)了國內(nèi)噬菌體治療的先河。隨著抗生素的大量及不正確的使用，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性越來越嚴(yán)重，每年因細(xì)菌耐藥性死亡的人數(shù)也在逐漸攀升，據(jù)統(tǒng)計到2050年全球每年因細(xì)菌耐藥性死亡的人數(shù)達100萬人。噬菌體是一類能夠特異性地裂解宿主細(xì)菌，不污染環(huán)境、無殘留、不易產(chǎn)生耐藥性的病毒，有望成為抗生素的替代藥物。但是，目前臨床上針對奇異變形桿菌并沒有多少裂解性能較好的噬菌體。
研究針對犬源奇異變形桿菌從污水中成功分離到裂解性噬菌體vB_PmM_XNR，電子顯微鏡觀察vB_PmM_XNR具有二十面體頭部結(jié)構(gòu)和可收縮尾部，可判斷為肌尾噬菌體科。噬菌體感染復(fù)數(shù)（MOI）能夠表示出感染時噬菌體與細(xì)菌的數(shù)量比值，也是平均每個細(xì)胞感染噬菌體的數(shù)量，可應(yīng)用于制備高濃度噬菌體裂解液。研究中，噬菌體XNR的MOI為0.01。按照噬菌體MOI繪制一步生長曲線，可以計算出潛伏期為15 min，爆發(fā)期持續(xù)40 min，爆發(fā)量為80 PFU·cell-1。這與大多數(shù)報道的噬菌體的潛伏期和爆發(fā)期結(jié)果基本相一致，但是爆發(fā)量各報道間差異較大。
吸附過程是噬菌體能夠裂解細(xì)菌的重要步驟，多數(shù)研究表明，吸附過程極易遭受環(huán)境（pH、溫度、離子等）因素的影響，在應(yīng)用過程中，噬菌體還要保證在體內(nèi)（血液、消化液）等極端環(huán)境下生存，因此，要求噬菌體對酸堿度、溫度等有一定的耐受性。vB_PmM_XNR在4℃至42℃之間滴度穩(wěn)定，滿足噬菌體吸附的最佳溫度范圍；pH 6.0～8.0范圍內(nèi)活性最好，具有體內(nèi)應(yīng)用治療的潛力。該噬菌體經(jīng)分離純化后，效價穩(wěn)定、較高，在適宜的條件下24 h可使奇異變形桿菌下降3個數(shù)量級，說明XNR具有較好的裂解效率，具有潛在應(yīng)用價值。噬菌體通過宿主菌及自限性繁殖，是噬菌體具有的基本特征。在裂解奇異變形桿菌的同時，XNR效價從108PFU·mL-1增至109PFU·mL-1，說明噬菌體在裂解細(xì)胞后能夠維持效價穩(wěn)定，并且有所增加，能夠發(fā)揮持續(xù)的裂解作用。
試驗從臨床尿石癥病犬尿液中分離獲得奇異變形桿菌。菌株具有溶血活性，能產(chǎn)生脲酶，具有耐藥性，滿足感染性結(jié)石癥的特征。以奇異變形桿菌分離株為宿主菌，分離出一株裂解性噬菌體，命名為vB_PmM_XNR。該噬菌體通過對其生物學(xué)特性、體外抗菌試驗表明具有治療和控制奇異變形桿菌引起泌尿系統(tǒng)感染的潛力。
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