PlcR在炭疽芽胞桿菌A16R中對其生長狀態、溶血酶活性及神經磷脂酶活性影響（一）
炭疽芽胞桿菌()、蠟樣芽胞桿菌()和蘇云金芽胞桿菌()均屬于蠟樣芽胞桿菌群，在遺傳學上有很高的相似性。PlcR(Phospholipase C regulator)在蠟樣芽胞桿菌中是十分重要的調控因子，但基因在炭疽芽胞桿菌中發生一個無義突變導致在炭疽芽胞桿菌中產生一個截短PlcR蛋白。為了研究基因對炭疽芽胞桿菌功能的影響，文章以蠟樣芽胞桿菌CMCC6330基因組為模板，構建重組表達質粒pBE2A-后導入炭疽芽胞桿菌疫苗株A16R中獲得重組菌株，對其進行表型分析。結果顯示，炭疽芽胞桿菌重組菌株的溶血活性基本沒有恢復，但恢復了部分神經鞘磷脂酶活性，表明將蠟樣芽胞桿菌的基因導入炭疽芽胞桿菌后，可以直接激活神經鞘磷脂酶活性。
PlcR是廣泛存在于蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌中十分重要的多功能調控因子，它可激活多種編碼毒力因子的基因表達，如神經鞘磷脂酶、蛋白酶和溶血素等。在蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌中，PlcR蛋白受PapR的激活，PapR在的控制下以前肽形式表達后通過SecA分泌機制輸出到細胞外，在胞外成為激活的五肽形式后，再通過寡肽透性酶系統Opp進入細胞，與PlcR結合并激活PlcR，從而與PlcRbox結合，進而調控染色體上的幾十個基因。改變基因的序列可使蠟樣芽胞桿菌與蘇云金芽胞桿菌中的溶血素和細胞毒素的表達與活性減弱。在蠟樣芽胞桿菌PlcR缺失株中，一些蛋白質如：神經鞘磷脂酶、溶血素、腸毒素及許多蛋白酶是不表達的。炭疽芽胞桿菌與蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌屬于蠟樣芽胞桿菌群，炭疽芽胞桿菌中存在與蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌同源的基因序列，但在炭疽芽胞桿菌當中基因發生了一個無義突變，導致其提前終止，故無法發揮其正常的功能。本文將蠟樣芽胞桿菌的基因導入炭疽芽胞桿菌減毒疫苗株A16R(pXO1+pXO2-)中并對其生長狀態、溶血酶活性及神經磷脂酶活性進行研究。
1材料和方法
1.1菌株及質粒
本實驗中用到的菌株及質粒見表1。
1.2方法
1.2.1 PlcR在A16R中的表達
1.2.1.1表達載體pBE2A-構建以CMCC-63301基因組為模板，用引物_F/R(表2)擴增編碼區片段，用HⅠ和Ⅰ酶切后連接到本實驗室保存的載體pBE2A上，構建重組表達質粒pBE2A-，在該重組質粒中，基因處于枯草芽胞桿菌淀粉酶基因啟動子的下游并受其調控。將構建好的重組表達質粒pBE2A-轉化到DH5α中，測序正確后，轉入大腸桿菌SCS110中去甲基化，后提質粒電擊轉化到炭疽芽胞桿菌中疫苗株A16R中構建pBE2A-/A16R，同時把表達載體pBE2A也導入A16R中，構建pBE2A/A16R的用作對照。
1.2.1.2 PlcR表達、純化及抗PlcR多克隆抗體制備為了將來檢測基因是否在炭疽芽胞桿菌中中表達，我們制備了抗PlcR多克隆抗體，具體方法是：以CMCC63301基因組為模板，用引物pET_F/R(表2)擴增片段，用HⅠ和dⅢ酶切連接到pET32a載體上，將構建好的質粒化學轉化到DH5α中，測序正確后，轉化到BL21感受態中，構建pET32a-/BL21，同時用相同的方法構建pET32a/BL21。
注：下劃線部分表示限制性酶切位點。
pET32a-/BL21誘導表達判斷蛋白的可溶性，用可溶性蛋白純化試劑盒純化蛋白。獲得純化好的蛋白后采用背點注射和腹腔注射免疫小鼠。一周后鼠尾取血ELISA測效價，效價比較高時開始眼球取全血，制備鼠多克隆抗體血清。
1.2.1.3 Western blot分析確認PlcR在炭疽芽胞桿菌中表達將構建的重組菌株pBE2A-/A16R和pBE2A/A16R培養13 h，各收集1 mL培養菌液，離心棄上清，菌體用200μL純水重懸，加入等體積的2×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸10 min，離心取上清，進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后，將蛋白轉印至PVDF膜上，用上述制備的PlcR小鼠多抗進行免疫印跡分析，使用低溫凝膠成像儀照相。
1.2.2表型分析
1.2.2.1生長曲線測定
在LB瓊脂平板上挑取A16R、pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R單克隆，轉接到含5 mL LB液體培養基試管中，在搖床中37℃、220 r/min培養12 h，吸取50μL轉接至新鮮5 mL LB試管中同樣條件下培養12 h。吸取1 mL的菌液，轉接于含100 mL LB的500 mL三角瓶中培養(37℃，220 r/min)。每隔1 h取出三角瓶，測定600并記錄，繪制成生長曲線。
1.2.2.2溶血現象觀察
在平板上挑取蠟樣芽胞桿菌CMCC63301、炭疽芽胞桿菌中A16R、pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R單克隆，接到5 mL LB液體培養基試管中，37℃、220 r/min培養13 h，將已滅菌的濾紙片貼到綿羊血平板后，吸取5μL菌液滴到濾紙片中間待菌液晾干后放置37℃恒溫培養箱中培養過夜，觀察是否有溶血環及溶血環大小。
1.2.2.3神經鞘磷脂酶活性觀察
在平板上挑取蠟樣芽胞桿菌CMCC63301、炭疽芽胞桿菌中A16R、pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R單克隆，接種到5 mL LB液體培養基試管中，37℃、220 r/min培養菌株13 h，各吸取5μL菌液滴加到配制好的卵磷脂瓊脂培養基(LB培養基+50%葡萄糖水溶液+50%卵黃鹽水懸液)中待菌液晾干后放置37℃恒溫培養箱中培養過夜，觀察是否有乳白色神經鞘磷脂酶消化環及消化環大小。
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