銅綠假單胞菌適配體的篩選和裁剪【研究進(jìn)展】
銅綠假單胞菌是一種專性需氧的革蘭氏陰性菌，是引起人類機(jī)會性感染的最主要的微生物，對人類造成多種健康威脅。因此，快速、靈敏、特異的檢測對預(yù)防及治療銅綠假單胞菌感染十分關(guān)鍵。目前常規(guī)的檢測方法仍存在耗時(shí)久、成本高、操作難度大等問題，因此需要更加高效經(jīng)濟(jì)的檢測方法。適配體是一種從隨機(jī)文庫中篩選出來的寡核苷酸，能夠形成多種復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，近年來，由于其易于合成和修飾，并且具有高親和力和強(qiáng)特異性而受到了廣泛的關(guān)注，也涌現(xiàn)出了大量基于適配體的銅綠假單胞菌檢測和防治的研究。
適配體是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）得到的具有特異性識別能力的人工合成寡核苷酸序列，1990年首次通過體外篩選被開發(fā)[8]。適配體一般為幾十個(gè)堿基構(gòu)成的DNA或者RNA序列，目前已經(jīng)有超過千項(xiàng)的適配體篩選研究被報(bào)道[9]。適配體的可識別靶標(biāo)十分豐富，包括重金屬、細(xì)胞、蛋白質(zhì)等多種物質(zhì)[10]。由于其具有高親和力、高特異性且易于合成和修飾等特點(diǎn)，得到了廣泛的研究。
本文總結(jié)了目前銅綠假單胞菌適配體的篩選和裁剪方面的研究進(jìn)展。
銅綠假單胞菌的篩選和裁剪
高性能適配體的獲得是實(shí)現(xiàn)多領(lǐng)域應(yīng)用的基礎(chǔ)，為了獲得更好的適配體，往往需要進(jìn)行篩選和裁剪。在適配體的篩選中，首先對寡核苷酸文庫進(jìn)行制備，并將含有隨機(jī)寡核苷酸數(shù)量超過1014以上的RNA或者DNA文庫與靶標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行孵育，經(jīng)過一定時(shí)間的反應(yīng)后，將可以與靶標(biāo)結(jié)合的核酸序列與未結(jié)合的核酸序列進(jìn)行分離，對于可結(jié)合靶標(biāo)的核酸，通過PCR等方式對其進(jìn)行擴(kuò)增，以生成新的寡核苷酸庫。重復(fù)以上步驟5-15次后對富集文庫進(jìn)行測序，并通過多種技術(shù)對測序得到的序列進(jìn)行親和力和特異性分析，最終從數(shù)量龐大的文庫中得到具有優(yōu)越性能的適配體序列用于下一步的傳感器開發(fā)（圖1）[11?-13]。盡管通過幾輪甚至十幾輪的篩選，可以從中獲得較好的核酸序列，但是由于隨機(jī)文庫篩選中固有的局限性，即使隨機(jī)文庫中已經(jīng)具有相當(dāng)多數(shù)量的核酸序列，篩選獲得適配體序列依然可能存在部分堿基在特異性的識別中不能發(fā)揮積極的作用，因此通過裁剪對這些冗余的堿基進(jìn)行去除或?qū)τ行A基進(jìn)行重復(fù)有助于獲得性能更優(yōu)的適配體。目前，針對銅綠假單胞菌已有多種適配體得到了開發(fā)和應(yīng)用，除了以微生物適配體篩選中常見的全細(xì)胞作為篩選靶標(biāo)外，銅綠假單胞菌的外毒素A和脂多糖也被用作靶標(biāo)進(jìn)行相關(guān)適配體的篩選（表1），多種銅綠假單胞菌靶標(biāo)適配體的篩選為其檢測提供了更加廣泛的可能性。此外，在已經(jīng)篩選的銅綠假單胞菌適配體中，既包括DNA適配體，也包括RNA適配體。
圖1 SELEX流程圖
表1銅綠假單胞菌適配體的篩選
全菌是微生物適配體篩選中最常見的靶標(biāo)，利用菌體較大的特點(diǎn)，通過離心操作可以有效的分離結(jié)合序列和未結(jié)合序列，在銅綠假單胞菌的適配體篩選中，既包括了以死菌為靶標(biāo)的適配體篩選，也包括了以活菌作為靶標(biāo)的篩選。2011年，Wang等[14]首次對銅綠假單胞菌的適配體進(jìn)行了篩選，經(jīng)過15輪的篩選，文庫通過流式細(xì)胞術(shù)測定的結(jié)合能力不再繼續(xù)增加，因此結(jié)束篩選進(jìn)行核酸測序，經(jīng)過測序得到了親和力為（17.27±5.00）nmol/L的適配體序列。2017年，Soundy等[15]首次針對活的銅綠假單胞菌開展了適配體的篩選。經(jīng)過7輪的全細(xì)胞篩選，對熒光標(biāo)記的適配體進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，第7輪文庫與靶標(biāo)的結(jié)合效果與初始文庫相比有了顯著的增強(qiáng)，經(jīng)過測序得到了適配體序列JN08和JN27，經(jīng)過二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，JN27中單個(gè)莖環(huán)為唯一顯著的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。因此對該莖環(huán)部分單獨(dú)進(jìn)行序列合成，并通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行結(jié)合效果的評估，結(jié)果驗(yàn)證具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的適配體序列具有較好的結(jié)合效果，是篩選得到的長適配體序列的核心結(jié)合區(qū)域。
除了對全菌進(jìn)行篩選，銅綠假單胞菌的毒力因子也已經(jīng)作為靶標(biāo)物質(zhì)開展了適配體的篩選。外毒素A是銅綠假單胞菌重要的毒力因子，也是其感染的重要標(biāo)志物。Hong等[16]利用誘餌SELEX（Decoy-SELEX）對外毒素A的適配體進(jìn)行篩選。在篩選中牛血清白蛋白和霍亂毒素作為負(fù)篩靶標(biāo)使用，經(jīng)過14輪的篩選對測序得到的適配體序列，利用表面等離子共振進(jìn)行親和力的檢測，得到Kd值為4.2-4.5μmol/L。此外，Ye等[17]基于Capture-SELEX技術(shù)篩選得到了適用于包括銅綠假單胞菌在內(nèi)的多種菌脂多糖檢測的適配體，其長度為80 nt，由于較長的核酸序列難以從石墨烯表面進(jìn)行釋放，進(jìn)一步對其進(jìn)行裁剪，并利用等溫量熱滴定法對其親和力進(jìn)行評估，最終確定了27 nt的最佳適配體，該適配體可以對鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌的脂多糖進(jìn)行識別和結(jié)合，并且在裁剪中親和力從（102±17）nmol/L上升至（46.2±9.5）nmol/L。
除了這些DNA適配體，銅綠假單胞菌的RNA適配體也得到了開發(fā)。與DNA適配體相比，RNA適配體盡管穩(wěn)定性稍差但在內(nèi)化至細(xì)胞方面更具優(yōu)勢。利用氟修飾的RNA文庫，Davydova等[18]篩選得到了可以內(nèi)化到細(xì)菌細(xì)胞中的適配體，測序后發(fā)現(xiàn)，該適配體與銅綠假單胞菌rRNA片段相同，進(jìn)一步佐證了該適配體可以內(nèi)化至細(xì)菌細(xì)胞的可能性。
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