茶樹(shù)根際細(xì)菌菌株P(guān)5菌株對(duì)花生種子的促生機(jī)制
植物根際促生菌(plant growth-promoting rizobacteria,PGPR)是指以定殖或自由附著的方式生活在植物根際的一類細(xì)菌總稱[1]。它能改變根際土壤的理化性質(zhì)、提高根際土壤中對(duì)植物生長(zhǎng)有利的營(yíng)養(yǎng)元素的轉(zhuǎn)化[2]，也可通過(guò)分泌鐵載體、有機(jī)酸、生物表面活性劑、植物生長(zhǎng)激素等，直接或間接促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[3]。不同植物根際分離到的促生菌菌株對(duì)相應(yīng)植物的種子萌發(fā)可能具有一定的促進(jìn)作用。從柳枝稷根莖中分離篩選到可分泌IAA的Pseudomonas和Rhizobium細(xì)菌菌株，接種后可以提高鹽脅迫下柳枝稷種子的發(fā)芽率，促進(jìn)胚根和胚芽的生長(zhǎng)[4]。從西藏黑青稞根際篩選到的4株菌株對(duì)青稞種子發(fā)芽促進(jìn)作用顯著，但不同菌株影響有差異[5]。而從大豆種子中分離到的內(nèi)生芽孢桿菌菌株，大部分均表現(xiàn)出促進(jìn)大豆發(fā)芽的作用，其中促生作用最好的SN 10 E 1菌株為巨大芽孢桿菌[6]。也有報(bào)道表明促生作用并不僅僅局限在同種屬的植物中。
李青梅等發(fā)現(xiàn)，經(jīng)膠質(zhì)芽孢桿菌菌劑處理的黃瓜、番茄、茄子及辣椒等4種蔬菜種子的發(fā)芽率均高于對(duì)照，但對(duì)蔬菜幼苗根生長(zhǎng)的影響因蔬菜種類不同而異[7]。而從油菜根際土壤中分離到的3株菌N-1、N-15、K-25可使桔梗種子的發(fā)芽率和幼苗莖長(zhǎng)明顯高于對(duì)照，也證明從一種植物根際能分離到對(duì)另一種植物有促生作用的功能菌，促生菌在不同植物根際的分布和作用存在交叉現(xiàn)象[8]。
在前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室從茶樹(shù)根際分離篩選到4株細(xì)菌菌株，其中PseudomonashunanensisGD 3具有溶磷解鉀能力，AgrobacteriumradiobacterKKS-6-N 1菌株具有固氮能力，2個(gè)菌株對(duì)白菜、空心菜及莧菜具有促生作用[9-10]。P 5菌株是采集茶樹(shù)根際土壤、以阿須貝無(wú)氮培養(yǎng)基篩選獲得的1株細(xì)菌，具有一定的固氮效能，而其余的促生特性還未知。本研究擬通過(guò)P 5菌株與2株具優(yōu)良促生性能的GD 3和KKS-6-N 1進(jìn)行浸種試驗(yàn)，比較不同菌株對(duì)辣椒和花生種子萌發(fā)的影響；并通過(guò)灌根處理盆栽花生幼苗，研究P 5菌株對(duì)花生根際土壤微生物功能的影響效應(yīng)，從根本上解析P 5菌株的促生機(jī)制。
1材料
1.1供試菌株及材料
3株茶樹(shù)根際細(xì)菌菌株GD 3、KKS-6-N 1和P 5(未知種屬)均為本實(shí)驗(yàn)室從不同環(huán)境茶樹(shù)根際土壤中分離獲得，保存于本實(shí)驗(yàn)室。
1.2供試材料與土壤
供試花生及辣椒種子均為當(dāng)?shù)厥惺鄯N子。土壤來(lái)源于貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)貴州大學(xué)南校區(qū)農(nóng)田土壤(26°42′48″N，106°67′31″E)，去除表面枯枝浮土后，采集距表面20～50 cm處土壤，過(guò)篩后用于盆栽試驗(yàn)。
1.3培養(yǎng)基
LB培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基及馬丁培養(yǎng)基按《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》[11]，參考Mab等[12]的方法配制蛋白胨氨化培養(yǎng)基、吳翔等[13]的方法配制阿須貝氏無(wú)氮培養(yǎng)基，NBRIP培養(yǎng)基參考Nautiyal等[14]的方法，亞歷山大硅酸鹽培養(yǎng)基參考何琳燕等[15]的方法。
2方法
2.1菌種的活化及菌液的制備
將保存于-80℃超低溫冰箱中的GD 3、KKS-6-N 1和P 5菌液取出適量，接種于LB培養(yǎng)基中，于30℃恒溫?fù)u床中，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)過(guò)夜活化；翌日取活化的菌液再次轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)24 h，菌液測(cè)定OD600值，以無(wú)菌LB調(diào)整該值為1.0備用。
2.2菌株浸種處理對(duì)辣椒種子萌發(fā)及盆栽試驗(yàn)的影響
將辣椒種子置于3%次氯酸鈉溶液中進(jìn)行表面消毒10 min，用蒸餾水反復(fù)清洗多次后，處理組的辣椒種子分別置于OD600值為1.0的3種菌液中浸種2 h，未處理組對(duì)照種子則置于LB培養(yǎng)基中；浸種完成后用無(wú)菌濾紙略微蘸干表面液體、置于鋪有被無(wú)菌水潤(rùn)濕的無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中放置15 d，期間保持濾紙濕潤(rùn)，統(tǒng)計(jì)辣椒種子的發(fā)芽率；之后移栽于裝有300 g土壤的育苗盆中進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，整個(gè)試驗(yàn)期間保持土壤濕潤(rùn)，30 d后收獲測(cè)定植株生長(zhǎng)指標(biāo)。試驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、GD 3處理組、KKS-6-N 1處理組和P 5處理組，每組為25粒種子，重復(fù)3次；盆栽試驗(yàn)時(shí)每組6株幼苗，重復(fù)3次。
2.3菌株浸種處理對(duì)花生種子萌發(fā)的影響
將花生種子置于20%過(guò)氧化氫溶液中進(jìn)行表面消毒20 min，經(jīng)蒸餾水反復(fù)清洗后浸泡6～12 h，以無(wú)菌濾紙略微蘸干后置于3種菌株的菌液中進(jìn)行2 h浸種處理，對(duì)照種子則置于LB培養(yǎng)基中；待浸種完成后，置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，30℃恒溫培養(yǎng)箱中放置3 d，統(tǒng)計(jì)花生種子的發(fā)芽率。種子試驗(yàn)設(shè)計(jì)及處理同上。
表1 3株茶樹(shù)根際細(xì)菌浸種對(duì)辣椒種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響
注：同一行不同小寫(xiě)字母代表不同處理之間差異顯著(p<0.05)。下同。
2.4菌株灌根處理對(duì)花生幼苗生長(zhǎng)的影響
將花生種子經(jīng)過(guò)氧化氫消毒，蒸餾水清洗浸泡后，置于鋪有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中，30℃條件下3 d待種子萌發(fā)后，選擇長(zhǎng)勢(shì)相當(dāng)?shù)幕ㄉ酌缫圃杂谟缗柚?，以未接種菌株為對(duì)照，設(shè)置GD 3接種組、KKS-6-N 1接種組和P 5接種組，每2 d采用灌根法接種菌液，接種量為每次5 mL，對(duì)照組則用等量無(wú)菌LB培養(yǎng)基代替，每組均設(shè)6個(gè)重復(fù)，常規(guī)方式管理。30 d后測(cè)定花生株高、鮮重、根重及葉綠素含量等生長(zhǎng)及生理指標(biāo)，葉綠素含量采用Arnon法測(cè)定。
2.5 P 5菌株灌根對(duì)花生營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)的影響
盆栽實(shí)驗(yàn)30 d后，測(cè)定P 5接種組及對(duì)照組花生植株的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)，植株全氮含量測(cè)定采用凱氏定氮法，全磷含量測(cè)定采用鉬銻抗比色法，全鉀含量測(cè)定采用火焰分光光度法[16]進(jìn)行。
2.6 P 5菌株灌根對(duì)花生根際土壤三大菌群及功能菌群的影響
30 d盆栽實(shí)驗(yàn)后，利用抖根法收集P 5處理組的花生根際土壤，測(cè)定土壤三大菌群(細(xì)菌總數(shù)、放線菌總數(shù)及真菌總數(shù))，功能菌群數(shù)量的測(cè)定包括氨化細(xì)菌、固氮菌、溶磷菌及解鉀菌等4種類型。細(xì)菌、放線菌及真菌總數(shù)分別以LB固體培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基及馬丁培養(yǎng)基測(cè)定，采用稀釋平板涂布法進(jìn)行計(jì)數(shù)；以蛋白胨氨化培養(yǎng)基培養(yǎng)氨化細(xì)菌，采用最大近似值法(MPN,most probable numbers)測(cè)定；固氮菌、溶磷菌及解鉀菌分別以阿須貝無(wú)氮培養(yǎng)基、NBRIP培養(yǎng)基及亞歷山大硅酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)，以稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)。
2.7 P 5菌株灌根對(duì)花生根際土壤酶活性的影響
采集P 5灌根處理30 d的花生根際土壤進(jìn)行土壤酶活性測(cè)定。土壤蔗糖酶酶活的測(cè)定采用硫代硫酸鈉滴定法，單位酶活是指每克干土所消耗的硫代硫酸鈉(0.05 mol·L-1)體積(mL·g-1)[17]；過(guò)氧化氫酶酶活采用高錳酸鉀滴定法，單位酶活是指每克干土于20 min內(nèi)所消耗的高錳酸鉀(0.1 mol·L-1)體積(mL·g-1)；脲酶酶活的測(cè)定采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法，單位酶活是指37℃條件下、24 h處理后每克風(fēng)干土壤中的氨氮含量(mg·g-1)[18]；中性磷酸酶酶活是指每克干土經(jīng)24 h處理后釋放酚的體積(mg·g-1)，參照吳金水等[19]的方法進(jìn)行測(cè)定。
2.8 P 5菌株的分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建
P 5菌株的初步鑒定采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行。利用細(xì)菌DNA提取試劑盒抽提菌株的DNA，以細(xì)菌16 S rRNA基因的通用引物對(duì)27 F/1492 R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上、下游引物序列分別為27 F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)，1492 R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)[20]。PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增條件參考王歡等[10]的方法。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)到有既定大小的條帶(約1 500 bp)送至上海英駿生物工程公司測(cè)序。獲得的核苷酸序列經(jīng)NCBI網(wǎng)站上BLAST進(jìn)行在線同源性比較，選擇相似性最高的結(jié)果進(jìn)行分析。選取克雷伯氏菌屬的不同種菌株用于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，以PseudomonasmooreiRW 10 T(AM 293566)作外群。采用Clustal W 2進(jìn)行多重序列比對(duì)、Mega 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行1 000次自展檢驗(yàn)[21]。
2.9數(shù)據(jù)分析與處理
采用SPSS 20.0軟件，以LSR多重比較對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
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