量化人類腸道菌種對艱難梭菌長期生長的影響（一）
摘要Summary
艱難梭菌(Clostridioides difficile)能夠短暫或長期定殖于人類腸道，并可能引發感染風險。這一過程受到人類腸道微生物群中復雜的分子與生態相互作用的深刻影響。通過研究艱難梭菌在人體腸道群落中經歷數百代的動態變化，我們發現其定殖模式包括穩定共存、不穩定性或競爭性排除。降低碳水化合物濃度使包含艱難梭菌和常見腸道共生菌普通擬桿菌的群落從競爭性排除轉變為共存，而這種轉變得益于交互喂養的增強。在這種環境下，艱難梭菌發生了兩處關鍵突變，使其代謝生態位從依賴脯氨酸轉向依賴葡萄糖。這些代謝改變顯著影響了艱難梭菌與腸道微生物群的種間相互作用，同時降低了小鼠的疾病的嚴重程度。綜上所述，與普通擬桿菌的相互作用在塑造艱難梭菌的長期生長動態和進化適應中發揮了關鍵作用，為制定針對艱難梭菌的防治策略提供了重要啟示。
結果Results
人類腸道菌種在群落中對艱難梭菌的長期生長具有差異性影響
艱難梭菌(C.difficile)可在不同生命階段的個體中定殖，持續時間各不相同，而人們對決定這些動態的因素仍然知之甚少。由于腸道微生物生態是艱難梭菌定殖的重要決定因素，我們采用了自下而上的微生物群落實驗，研究種間相互作用如何塑造艱難梭菌的長期生長動態。為此，我們將艱難梭菌DSM 27147(流行性核型027的參考菌株R20291)與9種多樣的人類腸道菌種共同培養在支持其生長的特定培養基中(圖1A和S1A；表S1和S2)。這些人類腸道菌種在不同個體中高度普遍存在，并涵蓋了人類腸道微生物群的系統發育多樣性。該群落包括以下物種：閃爍梭菌(Clostridium scindens,CS)：此前研究表明其在無菌小鼠中可抑制艱難梭菌的生長；梭菌(Clostridium hiranonis,CH)：通過代謝生態位重疊抑制艱難梭菌，并導致其代謝發生顯著變化；擬桿菌屬物種(包括單形擬桿菌(Bacteroides uniformis,BU)、多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron,BT)和普通擬桿菌(Phocaeicola vulgatus,PV)：在不同環境下可抑制或促進艱難梭菌的生長。此外，脫硫弧菌(Desulfovibrio piger,DP)、遲緩埃格特菌(Eggerthella lenta,EL)、產氣柯林斯菌(Collinsella aerofaciens,CA)和普雷沃菌(Prevotella copri,PC)與艱難梭菌的相互作用也已在短時間尺度(約5–10代)內得到廣泛研究。
圖1|艱難梭菌在人類腸道群落中的長期生長動態
(A)艱難梭菌在人類腸道群落中長期生長實驗示意圖。根據每個物種的16S rRNA序列生成了系統發育樹。
(B)利用時間序列絕對豐度數據推斷gLV模型參數。
(C)利用35次傳代的豐度數據推斷出艱難梭菌與9種腸道菌種之間的長期種間相互作用網絡。節點大小代表物種的環境容納量，邊的寬度代表長期種間相互作用系數(aij)的大小。腸道菌種之間的完整aij見圖S3A。
(D)艱難梭菌與腸道細菌在成對(左)和三成員(右)群落中的代表性群落動態。由彩色線條連接的數據點表示每個物種的相對豐度(左y軸)，而帶有95%置信區間陰影的灰色線條表示群落OD600(右y軸)。完整的群落動態見圖S1C(成對)和圖S2A(三成員)。穩定共存、不穩定共存和競爭排斥的分類依據圖S2B。(E)使用最后一個時間點相對于初始時間點的香農多樣性來測量所有包含x軸所示特定物種的成對和三成員群落中共存程度(ΔH)。
(F)在所有包含x軸所示特定物種的成對和三成員群落中，35次傳代過程中各時間點測量值之間歐幾里得距離的箱線圖。對于(E)和(F)，由于組間重疊群落的存在，某些數據點跨越了較大的多樣性空間，從而導致了變異性(示例數據點已突出顯示)。圖上方的星號表示該組與另一組之間雙向曼-惠特尼U檢驗的統計學顯著p值，星號顏色與另一組對應。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。確切的 p 值見表 S4。
我們組裝了所有可能的雙物種組合(共9種)和三物種組合(共36種)，其中包含艱難梭菌(C.difficile)和腸道細菌。這些菌群培養了24小時后，取少量樣品以40倍稀釋接種至新鮮培養基，連續傳代35次(約186代)(詳見STAR方法)。通過16S rRNA測序確定每種物種的相對豐度，并乘以各時間點的總生物量，估算每種物種的絕對豐度。此外，我們單獨培養了每種物種，采用相同的實驗設計(圖S1B)。結果顯示，艱難梭菌在60%的群落中持續存在(相對豐度>1%，直到最后一次傳代)，包括7/9的雙物種群落和20/36的三物種群落(圖S1C和S2A)。然而，在84%的群落中，艱難梭菌的絕對豐度從初代到最后一次傳代顯著下降(圖S1D)。某些物種(如PC和BT)在明顯抑制艱難梭菌的群落中被顯著富集。所有擬桿菌屬(Bacteroides)物種在單一培養或與艱難梭菌共培養時均顯著降低了培養基的pH值(培養基pH從7.1降至約4.9–5.3；圖S1E)。雖然其他腸道菌在單一培養或共培養中未顯著降低pH值，但PC僅在與艱難梭菌共培養時顯著酸化了培養基(pH從7.1降至5.1)，這可能與PC對艱難梭菌的抑制效應有關(圖S1D)。
為了量化人類腸道菌種對艱難梭菌長期生長的影響，我們采用廣義Lotka-Volterra(gLV)模型，對單一培養、雙物種和三物種群落在35次傳代中的物種豐度時間序列數據進行了擬合(圖1B；表S3 DATASET001；詳見STAR方法)。gLV模型是一種動態生態模型，可根據各物種的生長和與群落成員的雙物種相互作用預測群落動態。該模型廣泛用于解析物種間相互作用并預測不同環境中的群落組裝過程。推導出的gLV物種間相互作用系數量化了特定物種對另一物種長期生長的影響(圖S3A)。模型與實驗數據的擬合度較高(Pearson相關系數R=0.89–0.91，p=3.6E?42至2.3E?51；圖S3B)。為了評估模型對驗證數據的預測性能，我們進行了留一交叉驗證(圖S3C；詳見STAR方法)。由于用于訓練模型的數據有限，特別是腸道菌的相關數據，模型僅對艱難梭菌的豐度預測表現出中等一致性(艱難梭菌的Pearson相關系數R=0.36–0.60，總體相關系數R=0.63–0.70，p=1.5E?13至1.9E?18)。此外，gLV模型未能捕捉物種間相互作用的進化變化，這可能是預測性能較低的原因之一。