牦牛源短小芽孢桿菌生長曲線測定及藥敏試驗(yàn)、體外抑菌結(jié)果解讀（一）
[目的]本試驗(yàn)旨在研究一株牦牛源短小芽孢桿菌(命名:TS1)的分離鑒定、抗逆性、對常用抗菌藥物的耐藥性以及對常見致病菌的抑菌活性，初步探索其作為益生菌添加劑在畜牧養(yǎng)殖中應(yīng)用的可行性。[方法]對健康牦牛新鮮糞便進(jìn)行100℃水浴處理10 min以篩選具有抗逆性的芽胞桿菌，進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rRNA序列分析鑒定，通過測量生長曲線、耐酸、耐膽鹽試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)及抑菌試驗(yàn)等方法對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，通過全基因測序分析其可能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的類型。[結(jié)果]TS1為短小芽胞桿菌且具有耐酸、耐膽鹽生長特性;TS1對于12種常見的抗菌藥物敏感，且對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌具有抑菌作用。測序分析顯示該菌株可編碼與Amylocyclicin同源性達(dá)48.90%的一種新型抗菌肽，進(jìn)而發(fā)揮其抗菌活性。[結(jié)論]短小芽胞桿菌TS1有一定的抗逆性和潛在的益生能力及廣譜抗菌效果，并且在畜禽腸道微生物系統(tǒng)中對抗生素耐藥性傳遞的風(fēng)險(xiǎn)較低，適合作為益生菌添加劑類抗生素替代產(chǎn)品。
引言
抗菌藥物是人類和畜禽防治細(xì)菌感染的重要手段。隨著抗菌藥物的不當(dāng)使用或?yàn)E用，細(xì)菌對常用抗菌藥物的耐藥性日趨嚴(yán)重。因此，“飼料端禁抗、養(yǎng)殖端減抗、限抗”已成為全球共識。歐盟自2006年1月開始不允許抗菌藥物作為飼料添加劑使用，中國自2020年開始也禁止在畜禽養(yǎng)殖過程中作為飼料添加劑使用抗生素。在“禁抗限抗”的大背景下，急需開發(fā)抗生素替代產(chǎn)品用于畜禽臨床生產(chǎn)實(shí)踐。目前益生菌是應(yīng)用較廣的替代產(chǎn)品之一，益生菌添加劑不僅可以提高動(dòng)物生長速度，還可以維持腸道菌群平衡，并且可以通過調(diào)控畜禽腸道菌群維持腸道上皮的穩(wěn)態(tài)，從而促進(jìn)畜禽腸道健康。益生菌本身及其代謝產(chǎn)物又具有廣譜抗菌作用，因此篩選不同動(dòng)物來源的益生菌是“減抗限抗”大背景下抗生素替代品開發(fā)的有效方式。
農(nóng)業(yè)部2013年公布了飼料添加劑的品種目錄，共有13種類別，其中包括短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)。短小芽胞桿菌被廣泛應(yīng)用的優(yōu)勢:1)易保存、抗逆性好，分離、培養(yǎng)和保藏的條件簡單，對工業(yè)化工生產(chǎn)技術(shù)要求低，能夠在腸胃中保持穩(wěn)定作用并且保持較高活性;其芽胞對外在的惡劣環(huán)境(如熱、紫外線、電離輻射和低pH等)有較強(qiáng)抵抗作用;2)當(dāng)攝入足夠量時(shí)能夠預(yù)防或改善腹瀉，緩解不耐乳糖癥狀，預(yù)防生殖系統(tǒng)感染，增強(qiáng)畜禽免疫力，促進(jìn)腸道消化系統(tǒng)健康，降低血清膽固醇，幫助吸收營養(yǎng)成分與促進(jìn)畜禽生長等。綜上，短小芽胞桿菌具有易保存、活性成分高等優(yōu)勢，值得大量推廣和應(yīng)用。
本試驗(yàn)從健康牦牛糞便中分離到1株具有益生潛力的短小芽胞桿菌，對其形態(tài)學(xué)、生理生化、耐酸、耐膽鹽、對常用抗菌藥物的敏感性及對常見病原菌的抑菌活性等進(jìn)行研究，旨在評價(jià)其用于制備益生菌添加劑的可行性，為動(dòng)物來源的益生芽胞桿菌的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1樣品來源
于甘肅將軍山丹軍馬場無菌采集健康牦牛糞便，一部分用于室溫分離短小芽胞桿菌，剩余樣品-80℃保存。
1.2主要試劑
試驗(yàn)所需主要試劑為LB培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)、LB液體培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)、Landy培養(yǎng)基(上海瑞楚生物科技有限公司)、磷酸鹽緩沖液(PBS，南京諾唯贊生物科技股份有限公司)、革蘭氏染色液(南京建成生物工程研究所)、鹽酸(優(yōu)級純，HCl含量36%～38%)、牛膽鹽(上海源葉生物科技有限公司，膽酸含量大于等于60%)、細(xì)菌16S rRNA通用引物及PCR 2x Taq Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)、生化鑒定管(廣州環(huán)凱微生物科技有限公司)、藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司和北京索萊寶科技有限公司)等。
1.3菌株的分離與純化
取1 g左右牛糞樣品至裝有5 mL無菌生理鹽水的玻璃試管中，用封口膜封住管口于沸水中煮沸10 min;取煮沸后的100μL上清液至裝有5 mL LB液體培養(yǎng)基的EP管中，放入搖床，37℃、160～180 r·min-1振蕩培養(yǎng)16～18 h;取100μL菌液加入5 mL液體培養(yǎng)基中再次振蕩培養(yǎng)16 h;蘸取菌液在LB固體培養(yǎng)基中劃線，于37℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)12～18 h，挑取單菌落接種LB固體培養(yǎng)基于37℃恒溫箱培養(yǎng)12～18 h，再次挑取單菌落至5 mL LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)16～18 h，得到純化菌液。
相關(guān)新聞推薦
1、微生物合成食品功能因子方法、研究策略和進(jìn)展（三）
2、Comammox全程氨氧化微生物的發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)（一）
3、恒河猴肺中陰溝腸桿菌的分離鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)——摘要、材料和方法
4、木本植物根際微生物組裝的時(shí)空動(dòng)態(tài)規(guī)律及其與宿主協(xié)同抗逆機(jī)制