工程菌大腸桿菌EcN FGF19-01培養、生長曲線測定及改善慢性結腸炎作用研究(二)
6、蛋白質提取和免疫印跡
菌體蛋白提取:取適量菌液,離心后分別收集菌液和上清培養基,在菌液中加適量體積的混有蛋白酶抑制劑和磷脂酶抑制劑的變性RIPA裂解液(150 mM NaCl、10 mM TrispH7.2、0.1%SDS、1%Triton X-100、1%Deoxycholate和5 mM EDTA),冰浴下超聲破碎10s/10s,10 min后,4℃,12000 rmp離心20分鐘,取上清,得到菌體蛋白溶液。
培養基上清蛋白提取:取適量培養基上清,加入4倍體積的甲醇,混合均勻后4℃靜置3 h,4℃,10000 rmp離心10分鐘后棄上清,收集蛋白沉淀,將沉淀的蛋白用鹽酸胍乙醇溶液洗3次,20 min/次,使用含有蛋白酶抑制劑的1%SDS溶液溶解蛋白,得到培養基上清蛋白溶液。
Western blot:用Pierce公司的BCA Kit測蛋白濃度。測完濃度后,加5×SDSloading buffer(200 mM Tris-Cl、pH6.8、8%SDS、0.4%溴酚藍、40%甘油和400 mMDTT),100℃煮10分鐘,立即上樣進行免疫印跡檢測或-20℃貯存備用。
選用10%的不連續變性聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGE)進行垂直電泳,開始以80伏的電壓進行電泳,待染料前沿進入分離膠后將電壓提高到120伏繼續電泳,直到溴酚藍到達分離膠的底部(10×電泳液:Tris 30 g、Glycine 144 g、SDS 10 g,加ddH2O到1 L)。PVDF膜用甲醇泡15 sec,和膠一起放入轉膜緩沖液中平衡15 min(10×轉膜緩沖液:Tris 30 g、Glycine 144 g、甲醇200 ml,加水到1 L);然后按照陽極-海綿-濾紙-PVDF膜-膠-濾紙-海綿-陰極的順序安置好,放入轉膜容器中,4℃,380 mA,轉膜時間根據分子量不同而不同,一般為1-2 h。轉膜結束后取出PVDF膜,標好方向和marker,按需裁剪。用10%脫脂牛奶室溫封閉1 h,TBST洗三次,每次10 min(10×TBS:24.2 g Tris、80 g NaCl,用濃HCl調pH到7.6;TBST:1×TBS和0.1%Tween-20)。進行一抗反應,抗體配置在1×TBST+5%BSA中,室溫1-2小時或4℃過夜,回收抗體,4℃保存。PVDF膜接下來繼續用TBST洗三次,每次10 min,進行二抗反應,室溫一小時后TBST洗膜三次,每次10 min。ECL(AmershamBiosciences)顯影。anti-FGF19和anti-GAPDH一抗抗體均購自Cell SignalingTechnology公司。結果顯示,在無氧條件下EcN FGF19-01菌株顯著高表達FGF19蛋白。
7、Elisa試劑盒測定FGF19蛋白含量
細菌上清液FGF19含量測定:細菌經37度水浴解凍活化后,1:100接種后過夜搖菌,第二天1:100接種到EP管中,在厭氧條件下振蕩培養,分別在0、2、4、6、8、10和12h時收集培養基,離心后取上清液,按照Elisa試劑盒(proteintech,Human FGF19 ELISA Kit,KE00243)說明書測標準品及菌液上清的FGF19蛋白含量。結果顯示,EcN FGF19-01能夠分泌FGF19蛋白至培養基上清中,且在6h時分泌量最高(超過8 ng/ml)。
8、工程菌EcN FGF19-01微膠囊的制備
微膠囊是由藻酸鹽-多聚賴氨酸-藻酸鹽組成的,其制備步驟如下:1)設備連接。反應容器中注入225 ml的無菌聚合緩沖液,然后將其固定在工作臺上的微膠囊造粒儀控制單元上,并在控制單元上設置參數(振動頻率為1300Hz,電壓為1100v,轉速為75 rmp);2)細菌收集。5x109 CFU/mL的EcN FGF19和野生型EcN菌液各20 mL,離心后棄上清,并用PBS洗兩遍后離心收集菌體在50 mL的離心管中。收集好的菌液用1mL無菌的MPOS(3-嗎啉丙磺酸)清洗緩沖液進行重懸,然后加入20 mL1.5%的海藻酸鈉溶液混合形成細胞-藻酸鹽懸浮液;3)液珠固化。細胞-藻酸鹽懸浮液轉移至20 mL注射器中,并將其連接到層流空氣罩中的反應容器中,然后推動注射器,懸浮液隨即進入噴嘴,使用設定的參數使由噴嘴噴出的液滴快速分散開并進入聚合溶液中,攪拌使液珠成形;4)藻酸隔膜形成。
在液珠固化5 min后,停止攪拌并排凈聚合溶液,然后加入75 mL 0.1%多聚賴氨酸溶液攪拌10 min;5)清洗。排凈0.05%多聚賴氨酸溶液之后,第一次清洗即加入200 mL MPOS清洗溶液攪拌1min后排凈,然后進行第二次清洗即加入200 mL MPOS清洗溶液攪拌5 min后排凈;6)外部藻酸鹽隔膜形成。加入100 mL 0.03%藻酸鹽溶液,攪拌5 min后形成外部藻酸鹽隔膜,然后排凈藻酸鹽溶液;7)清洗。加入200 mL MPOS清洗溶液攪拌1min后排凈;8)解聚。加入200 ml解聚合溶液攪拌約10min使液珠芯材的藻酸鹽溶解,然后排凈解聚合溶液;9)膠囊收集。加入200 mL MPOS清洗溶液,重新懸浮膠囊并傳送至收集瓶進行收集。微膠囊分別命名為EcN FGF19-01和EcN WT。
9、實驗動物處理
野生型雄性C57BL/6小鼠購于上海斯萊克實驗動物中心。小鼠適應7天后,開始給予含Abx的飲用水,5天后換為正常飲水,稱體重后,將小鼠分為體重相當的3組,實驗組開始飲用3.5%DSS水溶液,并開始分別灌胃有活性的EcN FGF19-01菌和EcN WT菌(1*109 CFU/小鼠),或分別灌胃EcN FGF19-01和EcN WT微膠囊,每只小鼠灌胃200μL菌液或微膠囊,每天灌胃1次,持續1周。實驗過程中每天稱小鼠體重,并進行腹瀉評分(0-4)。小鼠養于SPF級動物房,飼養溫度為25℃晝夜12小時循環,實驗開始之前給予符合國際標準的食物及飲水飼養。實驗結束后小鼠用二氧化碳處死,收集各種組織,液氮冷凍后放入-80℃冰箱保存備用。結果顯示,灌胃工程化大腸桿菌EcN FGF19-01或包裹EcN FGF19-01的微膠囊均夠顯著改善結腸炎小鼠體重、降低腹瀉指數和腸道黏膜損傷。
10、組織學分析和評分
伊紅和蘇木素(Hematoxylin and eosin,H&E)染色采用標準步驟進行,對腸道形態進行組織學分析,然后對腸道受損情況進行雙盲評分。
11、統計分析
數值均以均值±標準誤表示。兩組間差別是否具有統計學意義采用非配對組間雙尾t檢驗進行檢測,兩組以上統計采用one-way或two-way ANOVA分析。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001為具有統計學差異。
綜上所述,創制一株表達分泌FGF19工程化大腸桿菌,同時探索其在改善結腸炎中應用價值。
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