轉錄水平解析昆蟲病原線蟲共生菌菌株新型殺菌蛋白PPIA-L20基因表達調控——結果與分析
2 結果與分析
2.1 不同發酵時間ppia-l20基因的表達變化
分別取4～84 h不同發酵時間點的NN6菌株的菌體細胞，提取Total RNA進行6次實時熒光定量PCR測定，結果(圖1)表明ppia-l20相對表達水平極不穩定且趨勢多樣，即使是使用同一內參基因16S rRNA。選取16S rRNA和ropB兩種內參基因，共同定量得到相似基因表達趨勢的8和12 h 2個時間點的菌株進行后續的轉錄組測序(圖1-F)。
圖1 不同發酵時間ppia-l20基因的表達水平
2.2 Xenorhabdus bovienii NN6發酵時間與菌體總數、活菌數、基因相對表達水平相關性分析
從圖2可知，隨著發酵時間的延長，菌體量逐漸增加。從表3可見，對數期活菌數與菌體總數(D600表示)與發酵時間成正相關，說明隨著發酵時間的延長，對數期的菌體大量繁殖，但與ppia-l20基因表達水平無相關性。
圖2 發酵過程中菌體量變化
表3 對數期活菌數、菌體總數、ppia-l20基因相對表達情況相關性分析
2.3 RNA-Seq測序數據質量分析
對8和12 h 2組不同發酵時間菌體細胞共6個樣本進行高通量測序，并對測序質量進行統計分析。結果(表4)顯示:原始測序序列(raw reads)去除帶接頭序列、空序列及低質量測序序列后分別得到15 352 102、14 498 440、18 087 468、15 466 120、15 821 766、16 257 026條純凈序列(clean reads)，堿基GC含量平均為48.86%，低質量堿基測序序列(<Q20)占原始序列的比例很低，而高質量堿基序列(≥Q20)平均比例達到98.18%，說明測序數據的堿基組成情況和質量良好。將過濾后的測序序列比對到參考基因組上，發現測序序列均勻覆蓋在參考基因組上，能定位到基因組上測序序列的平均比例達87.89%。這些結果表明此次測序序列的整體質量良好，測序數據隨機性良好，可用于后續的分析。
表4 測序數據質量統計
2.4 Xenorhabdus bovienii NN6兩組間差異表達基因(DEG)分析
以發酵8 h菌體中的基因表達水平為參照，利用DESeq2(V1.6.3)分析發酵12 h菌體中差異表達的基因，設置篩選閾值 P<0.05，log2(Fold change)>1，構建火山圖(圖3-A)。RNA-seq共檢測到2 716個基因，其中466個DEG，基因組占比17.2%，其中193個DEG上調，273個DEG下調。DEG的熱圖聚類分析表明重復組內基因表達趨勢基本相同，組間差異顯著(圖3-B)。
圖3 Xenorhabdus bovienii NN6兩組間差異表達基因
2.5 RT-qPCR驗證轉錄組數據
隨機選取8個DEG(包括4個上調基因和4個下調基因)和2個表達差異不顯著的基因，Real-time PCR驗證結果(圖4)顯示基因表達趨勢與測序數據結果一致，說明RNA-seq轉錄組測序結果數據可靠。
圖4 RNA-seq數據與RT-qPCR比對
2.6 Xenorhabdus bovienii NN6兩組間GO富集分析
進一步對8和12 h 2組中的DEG進行GO注釋分析，結果(圖5)顯示有442個DEG注釋到生物學過程、細胞組分和分子功能大類的31個功能小類中。分子功能分類中含有最多的差異基因，分子功能中差異基因主要歸屬于雜環化合物結合、轉錄調節因子活性、氮化合物代謝和轉移酶活性等。生物學功能和細胞組分分類中的差異基因數量少于分子功能分類，生物學過程中差異基因主要富集在代謝過程和應激反應。值得注意的是，細胞組分分類中僅富集到2個功能小類，主要歸屬于細胞和膜部分，與細胞膜的功能相關。這表明Xenorhabdus bovienii NN6菌株可能在發酵過程中代謝活躍，ppia-l20表達量變化可能與轉移酶活性和膜蛋白轉運過程有關。
為了探究DEG在ppia-l20基因表達變化中的潛在功能，對所有DEG進行GO富集分析，分別統計生物過程(BP)、細胞成分(CC)和分子功能(MF)3個分類富集程度前10的GO條目，圖6結果表明在這30個GO條目中，差異表達基因在生物過程中主要富集于細胞膜(membrane)、定位(localization)、水解酶(hydrolase activity)、膜整體成分(integral component of membrane)、膜內成分(intrinsic component of membrane)、轉運活性(transporter activity)。其中細胞膜(membrane)的富集率最高為77.5%，表明在發酵過程中Xenorhabdus bovienii NN6菌株與膜相關GO條目中的77.5%的基因差異表達，提示發酵過程中ppia-l20基因表達升高可能與細胞膜功能相關蛋白的表達密切相關。
圖5 Xenorhabdus bovienii NN6兩組間差異表達基因的GO注釋分類圖
圖6 Xenorhabdus bovienii NN6組間差異表達基因各分類前10的GO富集分析
2.7 Xenorhabdus bovienii NN6兩組間DEG的KEGG富集分析
KEGG注釋結果(圖7)顯示，有191個DEG注釋到了62個KEGG代謝通路?；贙EGG數據庫(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)進行通路分析，其中13條通路的可信度顯著(P<0.05)。上調基因主要富集在次級代謝產物合成、氨基酸合成、雙組分調節系統相關通路; 下調基因主要富集在次級代謝產物合成相關通路、鞭毛組裝與磷酸轉移酶系統相關通路。
圖7 Xenorhabdus bovienii NN6差異表達基因前20的KEGG富集分析
2.8 KEGG關鍵通路中代表性DEG分析
從表5可知，參與雙組分調節系統共有14個DEG，其中12個表達上調2個表達下調。ompR基因編碼的轉錄調控蛋白OmpR是雙組分調節系統的關鍵蛋白，qseC基因編碼雙組分傳感器激酶N端結構。目的基因ppia-l20位于陽離子抗菌肽抵制通路中，位于同一條通路上的3個基因中，arnF和eamA編碼的蛋白屬于DUF6轉錄因子家族，其表達上調，另一個基因nlpE負責編碼外膜脂蛋白，參與銅離子的攝取和黏附功能，其表達下調。
表5 關鍵通路中代表性差異基因表達情況
2.9 PPIA-L20相關蛋白互作網絡分析
通過STRING對PPIA-L20蛋白進行蛋白互作網絡構建，以獲取其潛在蛋白的互作關系，如圖8所示，PPIA-L20可能與AMPs結合蛋白TycC、GrsB、ATP酶HtpG、酮酰合成酶N端PpsE蛋白等蛋白相互作用，AMPs結合蛋白TycC、GrsB定位于細胞外膜，用于識別外界AMPs結合信號，ATP酶HtpG和酮酰合成酶N端PpsE蛋白參與細胞的能量代謝過程。
GO富集分析表明，ppia-l20基因變化與細胞膜的變化、轉移酶活性、代謝過程相關，KEGG通路分析預測，PPIA-L20蛋白位于陽離子抗菌肽抵抗通路，與雙組分調節系統、磷酸轉移酶系統活動相關; 與PPIA-L20蛋白位于共同通路(陽離子抗菌肽抵抗通路)的nlpE基因表達的外膜脂蛋白NlpE屬于DUF6轉錄因子家族，NlpE蛋白與雙組分調節系統中的cpxR基因、cpxA基因表達的蛋白具有互作關系。在腸桿菌科中，控制AMPs耐藥性的基因通常受雙組分信號通路以及磷酸轉移系統的控制，NlpE蛋白同時存在于PPIA-L20蛋白共同通路(陽離子抗菌肽抵抗通路)的上游，可能起到調控ppia-l20基因表達的作用，該蛋白相互作用網絡的構建為調控機制的推測提供線索。
圖8 蛋白互作的網絡預測