E-test法多黏菌素藥敏條用于臨床腸桿菌科體外藥敏檢測（一）
腸桿菌科細(xì)菌是革蘭陰性菌中非常重要的一類微生物，是引起臨床感染的重要病原菌之一，可致化膿性疾病、肺炎、腦膜炎、菌血癥以及傷口、泌尿道和腸道的感染。多黏菌素是從多黏類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)培養(yǎng)液中獲得的多肽類抗生素，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)共分為5型，其中僅B和E應(yīng)用于臨床，主要用于治療革蘭陰性菌所致的全身多位點感染，因其較嚴(yán)重的腎毒性及神經(jīng)系統(tǒng)毒性曾經(jīng)一度被棄用。近年來，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，腸桿菌科細(xì)菌對多種抗菌藥物產(chǎn)生了耐藥性，多黏菌素類作為治療的最后選擇又被應(yīng)用于臨床。本研究結(jié)合最新2018版美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究協(xié)會(CLSI)M100-S28標(biāo)準(zhǔn)，收集了2018年上半年河南省人民醫(yī)院、河南省中醫(yī)一附院、鄭州大學(xué)二附院臨床分離腸桿科菌株887株，同時采用E-test法和微量稀釋法進(jìn)行體外藥敏試驗，考察兩種方法的一致性，為臨床腸桿菌科細(xì)菌體外多黏菌素藥敏試驗提供參考，指導(dǎo)臨床合理進(jìn)行體外藥敏檢測。
1材料和方法
1.1菌株來源
本研究收集了2018年1月—6月河南省人民醫(yī)院、河南省中醫(yī)第一附屬醫(yī)院、鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床常規(guī)分離腸桿科菌株887份，其中埃希菌屬331株，克雷伯菌屬207株，沙門菌屬103株，志賀菌屬112株，其他屬腸桿菌134株(腸桿菌屬57株，檸檬酸桿菌屬48株，耶爾森菌屬13株，摩根菌屬7株，布丘菌屬6株，西地西菌屬3株)。質(zhì)控菌株采用ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸埃希菌(ATCC25922)、產(chǎn)酸克雷伯菌(ATCC700324)、肺炎克雷伯菌(ATCC700603)、肺炎克雷伯菌肺炎亞種(ATCC13883)、腸炎沙門菌(ATCC13076)、鼠傷沙門菌(ATCC14028)、索氏志賀菌(ATCC25931)、霍氏腸桿菌(ATCC700323)、人蒼白桿菌(ATCC49687)、人蒼白桿菌(ATCCBAA-749)均源于鄭州安圖生物工程股份有限公司。
1.2試劑
多黏菌素B藥敏條由鄭州安圖生物工程股份有限公司提供，血瓊脂平板、90mm Mueller-Hinton(MH)平板均由鄭州安圖生物工程股份有限公司提供。多黏菌素B抗菌藥物為標(biāo)準(zhǔn)品，購自中國食品藥品檢定研究院；MH肉湯購自于BD醫(yī)療器械(上海)有限公司。
1.3方法
按照多黏菌素B藥敏條說明書進(jìn)行操作。待測菌株和質(zhì)控菌株分純過夜，挑取純菌落制備濁度為1.5×108CFU/mL濃度菌液，用無菌棉簽浸蘸菌液涂布于90mm MH平板表面，放置5min后，用真空吸筆吸取藥敏條放置于平板上然后放置(35±1)℃孵育，孵育16～20h后，讀取抑菌圈邊緣與藥敏條相交位置處的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)值。微量稀釋法的操作和判讀參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)：在96孔酶標(biāo)板的2～12孔各加100μL肉湯培養(yǎng)基；加100μL含64μg/mL抗生素的肉湯培養(yǎng)基至第1和第2孔中；從第2～12孔作對倍稀釋；加100μL含有105CFU待檢細(xì)菌新鮮肉湯培養(yǎng)基于每一孔；設(shè)立陽性對照孔，陰性對照孔，抗生素對照孔；密封酶標(biāo)板，(35±1)℃環(huán)境下孵育20～24h，當(dāng)陽性對照孔明顯渾濁時，記錄MIC值。EA(essential agreement)：指待測方法與對比方法(或參考方法)MIC值在±1個稀釋倍數(shù)范圍內(nèi)的一致性。藥敏條與微量稀釋法比對超過±1個稀釋倍數(shù)時進(jìn)行復(fù)測，復(fù)測仍然超過±1個稀釋倍數(shù)判為不一致。
1.4統(tǒng)計學(xué)分析
采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＞0.05為無顯著性差異。
2結(jié)果
2.1質(zhì)控菌株檢測結(jié)果
本次質(zhì)控選用的9株ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株，均重復(fù)3次檢測，其中僅大腸埃希菌ATCC25922在CLSI有質(zhì)控范圍為0.5～2μg/mL，采用微量稀釋法和藥敏測定MIC值均在±1個稀釋倍數(shù)范圍內(nèi)，符合性能要求，具體數(shù)據(jù)見表1所示。
2.2樣本結(jié)果分析
共計887株腸桿菌的比對中，873株用藥敏條和微量稀釋法測定MIC值在±1個稀釋倍數(shù)的范圍內(nèi)。其中完全一致的有594株(594/887,66.97%)，±0.5個稀釋倍數(shù)的有170株(170/887,19.17%)，±1個稀釋倍數(shù)的有86株(86/887,9.70%)。有45株菌的MIC值超出了±1個稀釋倍數(shù)，EA%為94.93%(842/887)，針對第一次測定不符合的經(jīng)復(fù)測確認(rèn)，有36株菌測定結(jié)果仍然不符合，即糾正后的EA%為95.94%(851/887)，結(jié)果見表2所示。
表1標(biāo)準(zhǔn)菌株重復(fù)3次檢測結(jié)果
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