茂源鏈霉菌提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量方法【研究進(jìn)展】
茂原鏈霉菌高效合成耐熱谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶
近日，Journalof Agricultural and Food Chemistry在線發(fā)表了江南大學(xué)未來食品科學(xué)中心和生物工程學(xué)院陳堅(jiān)院士團(tuán)隊(duì)劉松研究員課題組的研究成果“Efficient Production of a Thermostable Mutant of Transglutaminase by Streptomyces mobaraensis”（Ye et al.,J.Agric.Food Chem.,2024.72(8):4207-4216.）。2021級(jí)碩士葉佳才為論文第一作者，劉松研究員為通訊作者，論文作者還包括周景文教授和堵國(guó)成教授。
谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（EC 2.3.2.13，TGase）能夠催化蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，廣泛應(yīng)用于肉制品、乳制品和豆制品等蛋白基食品的質(zhì)構(gòu)改良，并在制藥、紡織和皮革等非食品領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。茂原鏈霉菌（Streptomyces mobaraensis）食品添加劑國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2760規(guī)定的TGase生產(chǎn)菌株，是商品TGase的主要來源。然而，天然S.mobaraensis TGase熱穩(wěn)定性差，應(yīng)用領(lǐng)域受限。前期研究中，本團(tuán)隊(duì)對(duì)S.mobaraensis TGase進(jìn)行了理性改造，得到的突變體TGm2 60℃半衰期較野生酶提高33.45倍（J.Agric.FoodChem.,2021,69:15268?15278）。
然而，上述研究中TGm2只在大腸桿菌中進(jìn)行少量合成，并不適于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，實(shí)現(xiàn)耐熱TGase在食品安全菌株S.mobaraensis中的高效合成十分迫切。
針對(duì)上述問題，本研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合隨機(jī)誘變及定點(diǎn)基因整合在S.mobaraensis中高效合成了TGase耐熱突變體TGm2。首先，對(duì)S.mobaraensis DSM40587進(jìn)行ARTP誘變，篩選到一株TGase產(chǎn)量增加12.2倍的突變體smY2022，并確定了啟動(dòng)子核心區(qū)域（“-10區(qū)”G->A）的突變是導(dǎo)致其高產(chǎn)的重要原因。然后，優(yōu)化了同源臂的長(zhǎng)度提高了S.mobaraensis基因組中雙交換同源重組的效率，并將smY2022中野生型TGase的編碼序列替換為耐熱突變體TGm2的基因，得到重組菌株smY2022-TGm2，胞外TGase活性達(dá)到61.7 U/mL，是目前報(bào)道的TGase酶活最高的S.mobaraensis菌株。進(jìn)一步對(duì)TGm2的催化性能進(jìn)行了表征。在60°C時(shí)，TGm2的半衰期和比活性分別達(dá)到64 min和71.15 U/mg，分別是野生型TGase的35.6倍和2.9倍。進(jìn)一步比較了野生型TGase和TGm2對(duì)大豆分離蛋白、酪蛋白、乳清蛋白及牛血清蛋白的交聯(lián)能力。結(jié)果表明這2種酶在40°C時(shí)具有相似的能力，但TGm2在70°C時(shí)表現(xiàn)出明顯優(yōu)于野生型TGase的蛋白交聯(lián)能力。上述結(jié)果表明，smY2022-TGm2能夠高效合成耐熱TGase，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前言。
利用ARTP反復(fù)誘變茂源鏈霉菌提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量
本期向您推薦華東理工大學(xué)許建和教授、李春秀副教授科研團(tuán)隊(duì)，采用ARTP誘變育種技術(shù)處理茂源鏈霉菌，通過8輪ARTP誘變，獲得多株高產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（TGase）高產(chǎn)突變株，其中突變株Sm5-V1 TGase產(chǎn)量達(dá)到5.85 U/mL。該研究成果于2017年發(fā)表在《Bioresources and Bioprocessing》上（題目：Enhancing transglutaminase production of Streptomyces mobaraensis by iterative mutagenesis breeding with atmospheric and room?temperature plasma(ARTP)）。
谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TG酶)又稱為蛋白質(zhì)-谷氨酸-γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，能夠催化蛋白質(zhì)分子之間或之內(nèi)的交聯(lián)、蛋白質(zhì)和氨基酸之間的連接以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺殘基的水解，從而改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。因此，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。目前，應(yīng)用在食品工業(yè)領(lǐng)域的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶主要由茂源鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)。鑒于食品上對(duì)基因工程菌的限制，因此用誘變的方法選育TG酶高產(chǎn)菌株。
許建和教授、李春秀副教授科研團(tuán)隊(duì)利用ARTP技術(shù)對(duì)茂源鏈霉菌ECU7480進(jìn)行8輪誘變處理，共選擇了501個(gè)突變株進(jìn)行試管發(fā)酵篩選，研究多次反復(fù)誘變對(duì)TGase產(chǎn)量提升的累積效應(yīng)。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出結(jié)論，菌株的正突變率隨著誘變次數(shù)的增加而升高，而且最佳突變株TGase的產(chǎn)量也隨著反復(fù)誘變次數(shù)增多呈現(xiàn)波動(dòng)性提升的趨勢(shì)。最終，選育出四株高產(chǎn)菌株Sm5-V1,Sm6-V13,Sm2-V10,and Sm7-V12,其中Sm5-V1 TGase產(chǎn)量比出發(fā)菌株提升27%，達(dá)到5.85 U/mL，經(jīng)過8代遺傳后仍然保持穩(wěn)定。充分證明ARTP作為一種新型誘變手段，是工業(yè)育種的良好工具。
通過實(shí)時(shí)定量PCR分析和基因測(cè)序研究得出，與出發(fā)菌株分泌的TG酶相比，高產(chǎn)突變株TG酶酶原的結(jié)構(gòu)基因pro-smtg核苷酸序列并沒有發(fā)生改變，但pro-smtg的表達(dá)水平明顯提升，這可能是TG酶產(chǎn)量提高的原因。本研究針對(duì)目標(biāo)基因序列和轉(zhuǎn)錄水平的分析，為進(jìn)一步研究ARTP誘變產(chǎn)生的代謝過程的改變提供了重要的指導(dǎo)。
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