市售冷凍蝦尾的菌落總數(shù)測定及數(shù)學模型構建
近年來，人民對微生物污染食品，尤其是冷凍食品特別關注。而菌落總數(shù)的多少一貫是人們用來判定食品被細菌污染的程度，它能反應出食品在生產(chǎn)、流通，儲存過程中受污染的程度。菌落總數(shù)的多少在一定程度上標志著食品質(zhì)量的好壞。冷凍蝦尾做為一種較易儲存的水產(chǎn)品近年來尤其受到人民群眾的歡迎，但做為一種冷凍水制品，從最初的生產(chǎn)加工到最后供應到人們的餐桌，其流程長，且對溫度要求高，因此，更容易受到微生物的污染。
在日常的微生物檢驗中，因為樣品受污染的部位和程度不同，受制于取樣等環(huán)節(jié)的影響，所做的結果常差別較大，因此，檢驗結果的準確與否甚至會影響企業(yè)的效益甚至生存，尤其是微生物測定不合格，企業(yè)不能提出復檢。本文通過對10份市售冷凍蝦尾的菌落總數(shù)進行測定，根據(jù)GB/T 27418-2017《測量不確定度評定和表示》的規(guī)定，來對結果中不確定度的來源進行分析，并為此建立合適的數(shù)學模型進行分析，來評定冷凍蝦尾中菌落總數(shù)的不確定度。
1實驗材料、儀器和方法
1.1實驗材料樣品：隨機購買10個超市內(nèi)的冷凍蝦尾各一份，500g/份，用無菌袋包裝，立即放入-18℃的冰箱內(nèi)保存。
耗材：一次性無菌培養(yǎng)皿（江蘇華夏瑞泰塑業(yè)有限公司），平板計數(shù)瓊脂（北京陸橋計數(shù)股份有限公司）。
1.2儀器壓力蒸汽滅菌器（BKQ-B50Ⅱ）（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司生產(chǎn)）；電熱鼓風干燥箱（DHG-9075AE）（無錫瑪瑞科科技有限公司生產(chǎn)）；微生物恒溫培養(yǎng)箱（BJPX-Z1）（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司生產(chǎn)）；蘇凈安泰生物安全柜（BSC-1804ⅡB2）（江蘇蘇凈集團有限公司生產(chǎn)）。
1.3方法按照GB4789.2-2016中規(guī)定的方法進行實驗，具體步驟如下：①在無菌的條件下，稱取樣品25.0g，加入到含有225ml 0.9%的無菌生理鹽水的勻漿器，均質(zhì)，搖勻。②取新的無菌吸管做系列10倍濃度稀釋。③取1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000四個濃度梯度的樣品稀釋液，在每個樣品稀釋液中取1ml2次，分別加入到無菌培養(yǎng)皿中，另取1ml無菌生理鹽水加入另一無菌培養(yǎng)皿中，作為空白對照。④將冷卻至46℃左右的瓊脂培養(yǎng)基分別倒入無菌培養(yǎng)皿中約15ml～20ml，混勻，待瓊脂凝固后倒置。⑤將所有的培養(yǎng)皿放置于（36±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)（48±2）h。⑥選擇無菌培養(yǎng)皿中菌落數(shù)在30～300的培養(yǎng)皿，計數(shù)后乘以稀釋倍數(shù)，得到最終的計數(shù)結果。
2結果
2.1不確定度評價對10個冷凍蝦尾樣品的菌落總數(shù)的測定結果進行統(tǒng)計，具體數(shù)值見表1。
表1冷凍蝦尾中菌落總數(shù)的檢測結果及相關計算
從附表中的具體數(shù)據(jù)可以看出，該10份樣品中所測得菌落總數(shù)差異較大，因此，必須對檢測結果所得數(shù)值取對數(shù)后，再進行檢測結果對數(shù)值的標準偏差計算。按照統(tǒng)計學中A類評定，根據(jù)貝塞爾公式，計算最后結果：
在日常菌落總數(shù)的測定中，按照GB4789.2-2016的規(guī)定，每個稀釋濃度均會做2個平行樣，因此，在標準不確定度公式中，n=2，代入計算可得：。
在置信水平P=95%，V=10，通過查閱t分布表可得t95（10）=2.228。
根據(jù)擴展不確定度的公式U=KUC，代入計算可得，U=2.228×0.0253=0.0564。
2.2實驗結果報告根據(jù)2.1中計算的結果，筆者以1號樣品為例，其，其取值區(qū)間應為（5.8026±0.0564），計算可得5.7462～5.8590，取反對數(shù)后的區(qū)間為（557442～722770）CFU/g，因此，最后的檢測結果可估算為（5.6～7.2）×105CFU/g，其他樣品的取值范圍也可以依此類推。
3討論
在食品微生物檢驗中，不確定度來源很多，比如樣品被污染程度是否均一，取樣是否均一，每一步稀釋的體積誤差有多大，培養(yǎng)箱內(nèi)部的溫度差異有多大，培養(yǎng)的時間允差，最后計數(shù)的平行性等因素都是不確定度的來源。根據(jù)文獻可知，B類不確定度對食品微生物檢驗中的不確定度影響較小[1]。影響食品微生物檢驗的不確定主要因素還是人員的重復性，因此，采用統(tǒng)計學A類不確定度計算方法貝塞爾公式來計算標準偏差。根據(jù)貝塞爾公式的相關要求，一般要求對單一樣品測定10次以上，但是在日常實際工作中，幾乎沒有實驗室會這樣做[2]。因為在菌落總數(shù)的測定中，樣品檢驗都為破壞性檢驗，樣品檢驗一次后不能再重復檢驗，因此，對同一樣品做重復10次以上得到的結果意義不大。因此，本文通過對10批次冷凍蝦尾中的菌落總數(shù)進行測定，取對數(shù)后進行相關計算。
為了方便建立數(shù)學模型，要求所得到的實驗數(shù)據(jù)盡量符合正態(tài)分布，而從培養(yǎng)皿中直接計數(shù)后乘以稀釋濃度所得到的菌落總數(shù)為偏態(tài)分布[3]。因此，筆者對這些結果取對數(shù)后進行分析。通過實驗發(fā)現(xiàn)，要想使最后的結果比較完美，就應該嚴格控制實驗的每一個步驟，力求重復性一致。這就要求試驗人員要盡量避免實驗中的不確定度，并且盡可能的一個人完成所有操作，實驗中所使用的實驗容器和相關儀器一定要經(jīng)過相關部門的檢定并嚴格按照其操作規(guī)范的要求進行操作和使用。以最大限度地減少測定中的不確定度，保證結果的準確可靠。
對于一些檢驗結果在標準規(guī)定附近的結果，要根據(jù)CNAS-CL08《評價和報告測試結果與規(guī)定限量的符合性的要求》中的相關規(guī)定進行判定。例如，當檢驗的結果低于（高于）標準規(guī)定的值小于所測得的不確定度時，在95%的置信水平下，就不能做出不符合規(guī)定的處理[4]。
通過測定冷凍蝦尾中菌落總數(shù)的不確定度評價，可以更清楚地反應冷凍蝦尾的受污染情況，減少了實驗數(shù)據(jù)和真實值之間的誤差，更好地為人民群眾的飲食安全保駕護航。
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