膿腫分枝桿菌胞內菌落計數、對RAW264.7細胞血紅素氧化酶1調控自噬影響（一）
摘要
目的：探討血紅素氧化酶1（HO-1）調控自噬對膿腫分枝桿菌（M.abs）胞內生長的影響。
方法：M.abs標準株ATCC19977按照指定的感染復數（MOI）刺激小鼠RAW264.7巨噬細胞特定時間，Western blot檢測HO-1蛋白表達水平和自噬相關蛋白Atg5、LC3Ⅱ、p62蛋白表達水平。采用HO-1特異性誘導劑CoPP和酶活性抑制劑SnPP預處理巨噬細胞12 h，加入M.abs共孵育2 h，阿米卡星去除胞外菌后繼續培養至指定時間，CCK-8法檢測細胞活性；Western blot、LysoTracker Red檢測HO-1蛋白與自噬相關蛋白的調節關系；菌落計數、ELISA分別檢測細胞內細菌存活情況和TNF-α分泌水平。
結果：與對照組相比，M.abs能誘導HO-1和Atg5、LC3Ⅱ、p62蛋白表達水平升高；HO-1過表達和抑制能有效調控M.abs誘導的Atg5、LC3Ⅱ和p62表達。LysoTracker Red、菌落計數和ELISA結果顯示，SnPP促進細胞內溶酶體增加，顯著抑制M.abs胞內繁殖并減少TNF-α分泌。
結論：抑制HO-1能增強M.abs誘導的自噬流，減少M.abs胞內生長，為研發以抑制HO-1為靶點的靶向藥物提供科學依據。
非結核分枝桿菌是除了結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌外的分枝桿菌的總稱，也稱為非典型分枝桿菌（non-tuberculous mycobacteria，NTM）。膿腫分枝桿菌（Mycobacterium abscessus，M.abs）是臨床NTM分離株中最為常見的菌種之一。細菌對傳統藥物耐藥性高，需多種藥物聯合使用，治療療程長，不良反應多，預后較差，被臨床認為是最難治療的感染性疾病之一。目前，有文獻提出積極治療病原體和提高機體免疫調節并重的M.abs感染的治療方案。因此，研究以宿主導向治療（host-directed therapies，HDT）為核心的免疫治療手段可能是將來對M.abs治療的重點。自噬是機體為維持細胞內環境穩態而對受損蛋白進行分解代謝的一種固有免疫機制，可能是未來治療M.abs臨床應用的方向之一。典型自噬主要包括吞噬泡的形成、自噬體的形成、自噬溶酶體形成和降解。研究表明，機體自噬增強對細菌感染的清除具有重要意義，如人中性粒細胞可通過增強自噬途徑殺滅胞內類鼻疽伯克霍爾德菌。雖然機體可通過自噬清除胞內菌，但一些胞內菌也衍生出阻斷自噬流的策略，導致自噬無法完成生物學功能。KIM等發現M.abs臨床分離株可通過抑制自噬溶酶體融合促進其自身在胞內存活。因此，尋找到一種關鍵蛋白能有效調節自噬，可能為M.abs感染性疾病的免疫治療提供一種新的途徑。
血紅素氧化酶1（heme oxygenase 1，HO-1）是能催化游離血紅素降解為一氧化碳、亞鐵離子和膽綠素，對細胞和組織具有保護作用的酶，其催化產物一氧化碳和膽綠素均證明具有抗炎作用。然而HO-1在M.abs感染性疾病中具有不同作用。ABDALLA等證實抑制HO-1能有效抑制M.abs胞內存活，給予HO-1催化產物可恢復M.abs胞內繁殖。說明HO-1對于M.abs胞內增殖起到關鍵作用。SO和OH研究發現，siRNA干擾HO-1有效提高細胞LC3Ⅱ表達，Atg5 siRNA干擾癌細胞可誘導HO-1大量表達。說明HO-1與宿主自噬存在調節關系。但是HO-1對M.abs誘導自噬和溶酶體調節作用尚不清楚。基于HO-1在M.abs胞內增殖和細胞自噬中起到重要作用，本研究探討了HO-1對M.abs誘導自噬的調控關系及調控結局的影響，為后續抗菌藥物的研發提供科學理論和實驗依據。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1細胞和菌株來源
鼠源性RAW264.7細胞購于上海細胞庫細胞寶藏中心；M.abs標準株ATCC19977粗糙型（R型）由北京結核病診療技術創新聯盟惠贈。
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