膠滴腫瘤藥敏檢測技術(shù)檢測及評價不同藥物濃度的5'-DFUR對胃癌的療效（一）
近年來早期診斷和外科手術(shù)技術(shù)的發(fā)展，為癌癥患者帶來了希望。然而，胃癌作為中國發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤之一，復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率也較高，所以術(shù)后輔助化療仍然是胃癌綜合治療的重要組成部分。由于腫瘤的異質(zhì)性，即使同一化療方案，不同患者產(chǎn)生的療效也差異顯著，因此，選擇適合個體的化療藥物，既可提高療效避免不必要的不良反應(yīng)，同時也可減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。膠滴腫瘤藥敏檢測技術(shù)（collagen gel droplet embedded culture drug sensitivity test，CD-DST）是利用膠原凝膠在37℃時形成三維立體結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，將腫瘤細(xì)胞包埋于膠滴中，模擬體內(nèi)實(shí)體腫瘤細(xì)胞生長的微環(huán)境，從而在相似的生長環(huán)境中評價化療藥物的有效率。CD-DST具有原代細(xì)胞培養(yǎng)成功率高、所需細(xì)胞量少、檢測藥物種類多等優(yōu)點(diǎn)，使腫瘤個體化治療成為可能。該技術(shù)在腫瘤體外藥敏檢測中的應(yīng)用研究已有十余年的歷史。卡培他濱（capecitabine，CAP）作為5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）的前體藥物，也是胃癌輔助化療的常用藥，由于其不良反應(yīng)小，療效顯著，已被廣泛應(yīng)用于臨床。相較于其他抗腫瘤藥物，CAP具有更好的安全性和有效性。但截至目前未有研究報道在胃癌輔助化療中CAP的CD-DST培養(yǎng)條件，故本研究對CAP的CD-DST檢測條件進(jìn)行探索，對胃癌患者術(shù)后采用CD-DST法進(jìn)行CAP體外藥敏實(shí)驗(yàn)進(jìn)而指導(dǎo)臨床CAP用藥具有重要意義。
口服給藥后，CAP首先被肝臟中羧酸酯酶代謝為5'-脫氧-5-氟胞苷（5'-deoxy-5-fluorocytidine，5'-DFCR），然后通過肝臟和腫瘤組織中的胞苷脫氨酶將其轉(zhuǎn)化為5'-脫氧-5-氟尿苷（5'-deoxy-5-fluorouridine，5'-DFUR），最后在肝臟和腫瘤組織中胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TP）的作用下，將5'-DFUR進(jìn)一步代謝為5-FU發(fā)揮抗腫瘤作用。研究證實(shí)，TP是一種與腫瘤相關(guān)的血管生成因子，在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)高于正常細(xì)胞，這可能是一些研究者報道的惡性腫瘤優(yōu)先將5'-DFUR轉(zhuǎn)化為5-FU的重要原因之一。TP的活性決定了CAP的抗腫瘤效力。由于CAP代謝過程復(fù)雜不僅需要多種酶同時參與，并且需要肝臟起始代謝，體外代謝比較受限，無法實(shí)現(xiàn)CAP的體外CD-DST檢測及評價，而5'-DFUR僅需在腫瘤細(xì)胞中經(jīng)TP關(guān)鍵酶的一步代謝就可轉(zhuǎn)化為發(fā)揮抗腫瘤作用的5-FU，故本研究選擇CAP的代謝產(chǎn)物5'-DFUR進(jìn)行CAP的CD-DST檢測條件探索。
本研究選取65例新鮮胃癌組織標(biāo)本，體外通過對不同藥物濃度的5'-DFUR進(jìn)行CD-DST檢測及評價，并分析5'-DFUR在胃癌術(shù)后輔助化療中的敏感性與臨床有效率的一致性，進(jìn)而確定CD-DST法評價CAP進(jìn)行藥敏檢測的實(shí)驗(yàn)條件。
1對象與方法
1.1研究對象
選取2015年5月至2017年9月北京多家綜合性三級甲等醫(yī)院的65例胃癌患者的新鮮腫瘤組織標(biāo)本?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前經(jīng)胃鏡活檢病理診斷為胃癌；②無嚴(yán)重全身系統(tǒng)性疾??；③無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前采用化療或放療；②合并其他腫瘤；③有其他臟器切除。65例患者年齡38～87歲，性別、分型均隨機(jī)選取。將65例新鮮胃癌組織標(biāo)本根據(jù)入組時間順序分為實(shí)驗(yàn)組31例和驗(yàn)證組34例。
1.2主要試劑與儀器
DME/F-12 1∶1培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；胎牛血清購自美國Thermo Fisher公司；乙二醇二乙醚二胺四乙酸（ethylene glycol diethyl ether diamine tetraacetic acid，EGTA）、伊立替康（irinotecan，CPT-11）購自美國Sigma公司；5'-DFUR購自日本TCI公司；奧沙利鉑（oxaliplatin，L-OHP）購自比利時CENEXI-Laboratoires THISSEN S.A.公司；膠滴藥敏檢測試劑盒Primaster®購自日本Kurabo公司。倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；Primage圖像分析系統(tǒng)購自日本Kurabo公司。
1.3 CD-DST法
1.3.1原代腫瘤細(xì)胞分離與培養(yǎng)首先用生理鹽水洗滌腫瘤組織標(biāo)本5次，然后用眼科剪將腫瘤組織標(biāo)本剪成小塊，同時盡量去除如脂肪、黏膜、結(jié)締組織、壞死組織等非腫瘤細(xì)胞組織，再用刀片將組織切碎成泥狀，EZ酶消化1～2 h，1300 r/min離心3 min，收集消化后的腫瘤細(xì)胞團(tuán)塊，將其接種于CG培養(yǎng)瓶中，用PCM-1培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h，獲得原代胃癌細(xì)胞。
1.3.2膠原凝膠滴培養(yǎng)培養(yǎng)24 h后，收集預(yù)培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞，與試劑盒中膠原混合液（A∶B∶C=8∶1∶1）混合均勻，按照每膠滴30μl，每孔3個膠滴，將細(xì)胞懸液接種于6孔板中，2 h后待膠滴凝固加入3 ml含10%胎牛血清的DME/F-12 1∶1培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。
1.3.3抗腫瘤藥物接觸與清洗培養(yǎng)24 h后加入抗腫瘤藥物，藥物測試條件根據(jù)藥物服用特點(diǎn)、以往的研究結(jié)果及參考文獻(xiàn)，分別設(shè)未用藥物的陰性對照孔（Control）以及L-OHP和CPT-11（臨床胃癌常用藥）處理的陽性對照孔，同時將0-time組（加藥起點(diǎn)的未處理組）進(jìn)行染色固定。培養(yǎng)相應(yīng)時間后，用DME/F-12 1∶1培養(yǎng)基清洗2次，每次15 min，然后用無血清培養(yǎng)基PCM-2繼續(xù)培養(yǎng)5天，其中第3天更換一次培養(yǎng)基。
表1抗腫瘤藥物接觸條件表
1.3.4染色固定與掃描第9天進(jìn)行染色固定，使用終濃度為50μg/ml的中性紅染色2 h，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗細(xì)胞3次，每次5 min，中性福爾馬林固定45 min，蒸餾水清洗15 min，通風(fēng)干燥，分析具有活性的腫瘤細(xì)胞。（圖1）
圖1染色固定干燥后的胃癌細(xì)胞（中性紅染色，×40）
1.4數(shù)據(jù)分析
采用Primage圖像分析系統(tǒng)對膠滴進(jìn)行分析。Control組吸光度（optical density，OD）值與0-time組OD值的比值表示生長率，若生長率小于0.8，則判定為檢測沒有意義。
藥物敏感度通過加藥組OD值/Control組OD值（T/C）表示，若T/C＜50%，說明個體腫瘤細(xì)胞對相應(yīng)藥物敏感度較高（高敏感）；T/C為50%～60%，說明個體腫瘤細(xì)胞對相應(yīng)藥物敏感度處于高敏感與低敏感的臨界范圍（臨界）；T/C＞60%，說明個體腫瘤細(xì)胞對相應(yīng)藥物敏感度較低（耐藥）。
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