?高產(chǎn)纖維素酶枯草芽胞桿菌生長曲線、產(chǎn)蛋白酶及α-淀粉酶能力及藥物敏感性研究（一）
摘要： 旨在篩選潛在高產(chǎn)纖維素酶的益生菌并探究其益生作用以期用于生產(chǎn)實(shí)踐。從綿羊腸道內(nèi)容物中，利用羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）平板篩選產(chǎn)纖維素酶菌株，測(cè)定其纖維素酶活性，篩選出目標(biāo)菌株；采用形態(tài)學(xué)分析、生化試驗(yàn)和16S rDNA序列分析對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行鑒定；進(jìn)一步探究其生長曲線、產(chǎn)蛋白酶及α-淀粉酶能力、抑制病原菌能力、耐酸耐膽鹽能力、藥物敏感性和宿主安全性。結(jié)果：從樣品中篩選獲得8株產(chǎn)纖維素酶菌株，根據(jù)透明圈和菌落直徑比值以及纖維素酶活性篩選獲得產(chǎn)纖維素能力最強(qiáng)的菌株ECL1.2，其羧甲基纖維素酶活性為18.61 U/mL，經(jīng)鑒定為枯草芽胞桿菌；ECL1.2在培養(yǎng)12 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，在培養(yǎng)26 h時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期；其蛋白酶和α-淀粉酶活力分別為2.08 U/mL和19.7 U/mL；可抑制大腸桿菌、腸炎沙門菌和金黃色葡萄球菌的生長；在pH值為2～7培養(yǎng)4 h及膽鹽濃度為0.1%～0.3%培養(yǎng)8 h條件下存活率大于60%，具有一定耐酸耐膽鹽性；除對(duì)林可霉素低敏、對(duì)慶大霉素中敏外，對(duì)青霉素、頭孢唑啉、克拉霉素、諾氟沙星、萬古霉素、利福平極其敏感；對(duì)小鼠器官和腸道無危害，并能提高小鼠日增重和采食量。綜上，枯草芽胞桿菌ECL1.2可作為潛在益生菌。
1 引言
纖維素是一種廣泛存在的可再生生物資源，主要存在于植物和谷物中。使用纖維素降解酶利用纖維素資源是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，其對(duì)于工業(yè)和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展有極大的價(jià)值1。分泌高效降解組合酶菌株的選育是利用纖維素資源的關(guān)鍵，直接從自然環(huán)境中篩選菌株具有安全可靠性2。目前，在畜牧禽畜養(yǎng)殖行業(yè)，益生菌發(fā)酵飼料和發(fā)酵中藥等被廣泛用來提高飼料利用率、預(yù)防動(dòng)物疾病、提高生產(chǎn)性能、增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫和改善養(yǎng)殖環(huán)境等3?7。益生菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的纖維素胞外酶可以與底物作用，使飼料營養(yǎng)成分和中藥有效成分大量釋放，所以產(chǎn)纖維素酶能力的大小是進(jìn)行發(fā)酵菌株篩選的主要指標(biāo)。芽胞桿菌具有高產(chǎn)纖維素酶的能力，能夠在低pH值下存活，次級(jí)代謝產(chǎn)物在宿主體內(nèi)發(fā)揮益生作用，發(fā)酵產(chǎn)品在室溫下耐儲(chǔ)存等優(yōu)勢(shì)，因此被認(rèn)為是最理想的微生物添加劑8?9。
本試驗(yàn)從綿羊腸道中分離得到8株菌，并從中篩選出一株高產(chǎn)纖維素酶的芽胞桿菌菌株，且對(duì)其產(chǎn)蛋白酶和α-淀粉酶能力進(jìn)行了檢測(cè)，研究了其抑制病原菌和耐酸耐膽鹽能力和安全性，為篩選有效利用纖維素資源的益生菌奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
試驗(yàn)樣品取自10月齡健康綿羊的盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物，液氮速凍后-80℃保存；40只4周齡健康雌性昆明小鼠購于河南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
CMC-Na固體培養(yǎng)基：CMC-Na 5 g、酵母提取物2 g、K?HPO? 1 g、瓊脂20 g，去離子水定容至1 L；LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g、氯化鈉10 g去離子水定容至1 L（固體培養(yǎng)基需再添加20 g瓊脂）。瓊脂、蛋白胨、酵母提取物均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、可溶性淀粉、干酪素、磷酸氫二鉀等均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；福林酚購于北京索萊寶科技有限公司；剛果紅、復(fù)紅染液購自鄭州安圖生物有限公司；3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑、CMC-Na、牛膽鹽、枯草芽胞桿菌生化鑒定管購自青島海博生物有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物有限公司。
1.2 高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選
取采集的腸道內(nèi)容物樣本10 g，加入裝有90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，震蕩混勻，85℃水浴10 min，倍比梯度稀釋，吸取10??、10??、10??稀釋液100 μL均勻涂布于CMC-Na平板上，37℃培養(yǎng)24 h后選取單菌落純化2代。將分離菌株點(diǎn)種于CMC-Na平板上，做3個(gè)重復(fù)，用超純水做對(duì)照點(diǎn)，37℃培養(yǎng)24 h，剛果紅染色法染色后，觀察菌落周圍的透明圓，測(cè)量透明圓直徑（H）與菌落直徑（C）的比值。
將分離菌株接種至LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)36 h，離心取得上清液即為菌株的粗酶液。采用董雪麗10的DNS方法測(cè)定羧甲基纖維素酶（CMC酶）活力。酶活定義：1 mL液體酶在50℃，每分鐘水解CMC-Na底物，產(chǎn)生相當(dāng)于1 μg葡萄糖的還原糖量，為1個(gè)酶活單位（U/mL）。篩選出透明圓直徑與菌落直徑的比值最大以及CMC酶活性最高的菌株作為目標(biāo)菌株。
1.3 高產(chǎn)纖維素酶菌株鑒定
觀察目標(biāo)菌株在LB固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)并進(jìn)行革蘭染色鏡檢，進(jìn)行菌株形態(tài)學(xué)觀察。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，采用微量生化鑒定管進(jìn)行菌株生化特征分析。提取菌株的DNA，用27F/1492R通用引物對(duì)（27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′, 1492R: 5′-TACGGCTACCTTGTTACGACT-3′）進(jìn)行16S rDNA片段擴(kuò)增11。由擎科公司進(jìn)行測(cè)序，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。
1.4 生長曲線的建立
采用倍比稀釋法用LB平板測(cè)定目標(biāo)菌株在0～46 h的活菌數(shù)，每隔2 h進(jìn)行計(jì)數(shù)。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、活菌數(shù)量為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。
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