鵪鶉肺炎克雷伯菌血清型鑒定、耐藥性檢測(cè)及致病潛力（四）
3討論
肺炎克雷伯菌是一種重要的機(jī)會(huì)致病菌，常見(jiàn)于家禽、牲畜等動(dòng)物體內(nèi)。在禽類感染中，肺炎克雷伯菌可引起禽類腹瀉、腸道炎癥、出血等癥狀。本研究從腹瀉鵪鶉糞便中分離出2株肺炎克雷伯菌Ksp-A1和Ksp-A2.通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定、16SrDNA測(cè)序和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，確認(rèn)2株分離株均為肺炎克雷伯菌，其生化特性均符合肺炎克雷伯菌的典型特征，這為進(jìn)一步的分子生物學(xué)和耐藥性研究提供了基礎(chǔ)。表6各組小鼠死亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果近年來(lái)，由于規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)大量使用抗生素，耐藥性問(wèn)題逐漸成為一個(gè)必須攻破的難題。肺炎克雷伯菌能通過(guò)生成水解酶來(lái)抵御抗生素，這使得常見(jiàn)抗菌藥物對(duì)肺炎克雷伯菌所致疾病的治療難度加大。
本試驗(yàn)中所分離的Ksp-A1菌株攜帶blaSHV、aacC2、oqxAB、tetA、tetM和cat1共6種耐藥基因，Ksp-A2菌株攜帶blaSHV、aaaA1、aacC2、oqxAB、qnrA、tetA、tetM和cat1共8種耐藥基因，Ksp-A1和Ksp-A2均攜帶有blaSHV、aacC2、oqxAB、tetA、tetM和cat16種耐藥基因，其中blaSHV基因編碼一種β-內(nèi)酰胺酶，該酶能水解包括青霉素類和頭孢菌素類在內(nèi)的多種β-內(nèi)酰胺類抗菌藥。oqxAB基因編碼的OqxAB蛋白是一種多重耐藥外排泵，其對(duì)氟喹諾酮類、喹噁啉類、氨基糖苷類和氯霉素類等多種抗菌藥以及部分消毒劑類物質(zhì)具有外排作用。這種耐藥性的存在減少了藥物在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的累積濃度，從而降低了藥物的有效性。
tetA基因編碼四環(huán)素抗性蛋白tetA,該蛋白屬于主要促進(jìn)因子（MFS）家族，它是一種外排泵，能利用細(xì)胞膜上的質(zhì)子梯度作為能量來(lái)源來(lái)驅(qū)動(dòng)抗生素的外排，可以將四環(huán)素類抗菌藥從細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部運(yùn)輸?shù)酵獠凯h(huán)境中，從而減少細(xì)胞內(nèi)藥物的積累，使細(xì)菌對(duì)四環(huán)素類抗菌藥產(chǎn)生耐藥性。tetM基因編碼的蛋白是一種核糖體保護(hù)蛋白，它能賦予細(xì)菌對(duì)四環(huán)素類抗菌藥的耐藥性，這種耐藥性主要是通過(guò)保護(hù)細(xì)菌的核糖體免受四環(huán)素類藥物的抑制作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的，從而允許細(xì)菌在存在這些抗菌藥物的環(huán)境中生長(zhǎng)。cat1基因編碼過(guò)氧化氫酶蛋白，其能夠催化過(guò)氧化氫的分解，在控制體內(nèi)活性氧平衡中起重要作用。
此外，分離株Ksp-A2獨(dú)有的2種基因分別為aaaA1和qnrA,aaaA1基因是肺炎克雷伯菌中與耐藥性相關(guān)的一個(gè)重要基因，是AcrAB-TolC外排泵系統(tǒng)的一部分。外排泵是細(xì)菌細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)復(fù)合體，能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞的抗生素泵出細(xì)胞外，從而減少藥物在細(xì)胞內(nèi)的積累，使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，包括但不限于四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類等。qnrA基因編碼蛋白QnrA屬于五肽重復(fù)家族一員，能夠保護(hù)細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ免受喹諾酮類抗菌藥的抑制作用。肺炎克雷伯菌侵襲宿主機(jī)體的條件與其自身莢膜多糖、菌毛、分泌的毒素等有關(guān)。
本試驗(yàn)對(duì)分離株進(jìn)行血清型和毒力基因檢測(cè)，結(jié)果顯示，分離株Ksp-A1和Ksp-A2莢膜血清型均為K57,Hsu等研究報(bào)道，K57是與肺炎克雷伯菌相關(guān)的肺炎相關(guān)綜合征（PLA）莢膜類型之一，這表明本研究分離株可能具有與PLA相關(guān)的臨床特征。其中Ksp-A1菌株攜帶K88、hlyE、iucD、irp2、ompA和ompC6種毒力基因，Ksp-A2攜帶K88、hlyE、iucD、irp2、ompA、ompC和malX7種毒力基因。這些毒力基因在肺炎克雷伯菌和大腸桿菌致病機(jī)制中扮演著相似的角色。K88毒力基因編碼K88菌毛，其賦予細(xì)菌定植能力并促進(jìn)細(xì)菌黏附于宿主腸道上皮細(xì)胞，抵抗宿主的自然清除機(jī)制，并助其逃避免疫系統(tǒng)，引發(fā)腸道感染。hlyE基因編碼的溶血素E（HlyE）能夠形成跨膜孔洞，導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解。iucD基因編碼蛋白參與氣桿菌素生物合成途徑，氣桿菌素是一種鐵載體，可以幫助細(xì)菌從宿主中獲取必需的鐵元素。
iucD基因高表達(dá)的細(xì)菌在與宿主細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)中具有優(yōu)勢(shì)，能夠使致病菌更有效地獲取鐵元素，從而增強(qiáng)其自身致病性。irp2基因編碼鐵調(diào)節(jié)蛋白2（IRP2），它參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的鐵代謝，IRP2通過(guò)結(jié)合鐵反應(yīng)元件IREs來(lái)控制鐵代謝相關(guān)基因的表達(dá)。當(dāng)iucD和irp2基因共同作用時(shí)可能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)一步增強(qiáng)肺炎克雷伯菌的致病性，iucD基因能幫助細(xì)菌獲取鐵元素，而irp2基因則能幫助細(xì)菌調(diào)節(jié)和利用這些鐵元素，以支持其生長(zhǎng)和毒性因子的產(chǎn)生。在肺炎克雷伯菌中，ompA和ompC基因編碼的孔蛋白（Porins）是細(xì)菌外膜中的重要成分，在細(xì)菌的致病機(jī)制和耐藥性中起著關(guān)鍵作用。ompA基因編碼的OmpA蛋白是一種常見(jiàn)的外膜蛋白，它參與形成細(xì)菌外膜的孔道，控制分子進(jìn)出。OmpA在細(xì)菌的黏附、侵襲宿主細(xì)胞以及調(diào)節(jié)細(xì)菌表面特性中發(fā)揮作用，這些特性對(duì)于肺炎克雷伯菌的致病性至關(guān)重要。
ompC基因編碼的OmpC蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)菌對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)性和抗生素的通透性方面發(fā)揮作用。OmpC的存在可以控制抗菌藥進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞的量，從而影響細(xì)菌對(duì)某些抗菌藥物的敏感性。分離株Ksp-A2還攜帶有malX基因，其功能尚未被充分研究，但有研究表明它可能與細(xì)菌的生物膜形成相關(guān)。本研究對(duì)分離的2株肺炎克雷伯菌進(jìn)行生長(zhǎng)特性分析，結(jié)果顯示，分離株Ksp-A1和Ksp-A2均在培養(yǎng)2h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，其中Ksp-A1在12h達(dá)到生長(zhǎng)峰值，Ksp-A2在培養(yǎng)9h后到達(dá)生長(zhǎng)峰值，這與Li等報(bào)道的在合適培養(yǎng)條件下，肺炎克雷伯菌生長(zhǎng)速率和生長(zhǎng)曲線表現(xiàn)出明顯階段性變化的結(jié)果相一致。酸堿耐受性試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株Ksp-A1和Ksp-A2在pH4.0-9.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)較好，且pH7.0條件培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)最佳，這表明2株分離株均能適應(yīng)中性環(huán)境，具備較強(qiáng)的生存能力，與Cheng等發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌中性pH條件下生長(zhǎng)最佳的結(jié)果相符。
此外，分離株Ksp-A1和Ksp-A2的最佳接種量分別為3%和2%,顯示出不同菌株在接種量上的適應(yīng)性差異，這為后續(xù)的菌株應(yīng)用研究提供了參考。本研究通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)評(píng)估了分離株Ksp-A1和Ksp-A2的致病性，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組小鼠在注射后12h內(nèi)出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀，包括被毛粗亂、精神沉郁、呼吸困難和腹瀉，對(duì)照組小鼠活動(dòng)正常，表明分離株Ksp-A1和Ksp-A2具有強(qiáng)致病性。這與Weber-Dabrowska等高感染劑量情況下肺炎克雷伯菌能夠在小鼠體內(nèi)迅速引發(fā)病癥的研究結(jié)果一致。隨著菌液濃度增加，Ksp-A1和Ksp-A2的致死率呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，且分離株Ksp-A2的致死性明顯高于Ksp-A1,可能與其攜帶的malX毒力基因相關(guān)，這也表明毒力基因種類和數(shù)量與肺炎克雷伯菌致病性密切相關(guān)，攜帶特定毒力基因的菌株通常表現(xiàn)出更強(qiáng)致病能力和生存優(yōu)勢(shì)，尤其在宿主免疫系統(tǒng)壓力下。
綜上所述，本研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究相符，表明不同來(lái)源肺炎克雷伯菌在致病性和毒力基因組成上存在明顯差異，強(qiáng)調(diào)了肺炎克雷伯菌的高毒力潛力和其攜帶的多種毒力基因在致病過(guò)程中的重要性。試驗(yàn)結(jié)果不僅為研究肺炎克雷伯菌的致病機(jī)制提供依據(jù)，也為未來(lái)的疫苗開(kāi)發(fā)和治療策略制定提供重要的參考信息，后續(xù)可進(jìn)一步探索相關(guān)毒力基因的功能及其在肺炎克雷伯菌感染中的具體作用，以及開(kāi)發(fā)針對(duì)性的防治措施。
4結(jié)論
本研究從腹瀉鵪鶉糞便中分離出2株肺炎克雷伯菌Ksp-A1和Ksp-A2,2株分離株均為K57血清型，表現(xiàn)出多重耐藥性，攜帶blaSHV、aacC2、oqxAB、tetA、tetM和cat1等耐藥基因，以及K88、hlyE、iucD、irp2、ompA和ompC等毒力基因，對(duì)小鼠具有致病性，且其攜帶的毒力基因與致病性密切相關(guān)。
相關(guān)新聞推薦
1、納米銀的制備方法及對(duì)小麥赤霉病菌抗菌活性的影響（一）
2、發(fā)酵培養(yǎng)基有哪些成分組成，和種子培養(yǎng)基的不同
3、蒙自榿木根瘤中分離的Frankia An12菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定
4、鴨瘟病毒DEV gG 基因缺失株的構(gòu)建、體外生長(zhǎng)曲線和蝕斑形成能力測(cè)定
5、不同儲(chǔ)藏溫度下鮮豬肉細(xì)菌菌落總數(shù)測(cè)定及Logistic生長(zhǎng)曲線函數(shù)模型構(gòu)建（三）