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紅曲霉發酵方法、生長曲線及工藝優化

來源:江西科技師范大學 發布時間:2024-08-20 14:24:35 瀏覽:513 次

紅曲霉在發酵過程中產生莫納可林(Monacolin K),莫納可林能夠降低膽固醇,具有非常好的藥用價值。目前紅曲霉發酵生產莫納可林存在產量偏低、生產成本偏高等問題。碳源是構成菌體和產物的碳架及能量來源,不同的碳源會通過影響菌體形態進而影響所需產物的產量。氮源是構成菌體細胞中核酸、蛋白質和細胞質的主要成分,是菌體的生長發育和發酵代謝物的合成積累必不可少的物質基礎。發酵基質對于紅曲霉來說,是其生長、代謝、繁殖的物質基礎,因此發酵培養基的組成成分會對紅曲霉的生長狀況和莫納可林的生成產生很大的影響。因紅曲霉個體小、代謝旺盛等特點,對生長環境的要求也相對較嚴格,外界環境的變化很容易影響到紅曲霉的代謝途徑,使其產物發生明顯的改變,所以通過控制紅曲霉發酵時的發酵條件來增加莫納可林的產量已經成為一種現代微生物發酵技術常用的技術手段。公開號為CN107475301A的中國專利申請公開了一種高產紅曲色素和Monacolin K的功能紅曲的制備方法,所述方法通過在發酵過程中加入不同的金屬離子以及控制發酵溫度提高紅曲色素和莫納可林的產量。上述方法沒有從根本上去解決發酵培養基的成分影響紅曲霉的發酵生產莫納可林產量的問題。另外,影響紅曲霉發酵的外界環境因素有很多,不只是溫度的影響。因此有必要提出一種紅曲霉的發酵工藝優化方法。


紅曲霉的發酵工藝優化步驟:


步驟1:根據種子培養液制備基礎培養基,在基礎培養基中分別加入不同種類的碳源后發酵紅曲霉,測量基礎培養基中目標產物的產量,生成第一產量柱形圖,確定發酵培養基的目標碳源。種子培養液的pH為6.0,種子培養液包括:1克/升的酵母膏、1克/升的K2HPO4、0.01克/升的MgSO4·7H2O、0.01克/升的FeSO4·7H2O。在本實施例中,在多個250毫升的三角瓶中分別裝入80毫升種子培養液制備基礎培養基,將三角瓶在121℃滅菌30分鐘,分別加入不同種類的碳源,接種等量的紅曲霉,在28℃下,150r/min搖床發酵12天后,測量基礎培養基中目標產物的產量生成第一產量柱形圖。碳源指的是能夠為紅曲霉提供碳元素以支持其生長和代謝的有機化合物。碳源的種類包括葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、甘油、乳糖,選擇該6種碳源進行實驗獲取數據。目標碳源為甘油。


目標產物為莫納可林,測量基礎培養基中目標產物的產量的步驟:將發酵結束后的基礎培養基于50℃下烘干、粉碎得到發酵粉,加蒸餾水將發酵粉恢復至基礎培養基烘干前的體積得到發酵液,調整發酵液的pH為6.3,量取10毫升的發酵液,加入40毫升的甲醇,超聲反應20分鐘,50℃水浴2小時,間歇振蕩3-4次,3000r/min離心3分鐘,經0.45μm的濾膜過濾得到上清液,將上清液置于冰盒上通過高效液相色譜儀進行檢測。除此之外,還可以通過雙波長法測量基礎培養基中目標產物的含量,紅曲霉除了代謝生產莫納可林還會生產紅曲色素,紅曲色素會影響莫納可林的測量,利用紅曲色素在246納米和254納米波長處吸光值基本相同,而莫納可林在該兩處的吸光值存在明顯差異的特性,通過分光光度法測量基礎培養基在246納米和254納米處吸光值之差,從而有效的排除紅曲色素對測量的影響,達到準確測量的目的。


步驟2:在基礎培養基中分別加入不同濃度的目標碳源后發酵紅曲霉,測量基礎培養基中目標產物的產量,生成第一產量曲線,確定目標碳源的第一目標濃度。最高目標產物的產量所對應的目標碳源的濃度為第一目標濃度。本實施例的第一目標濃度為65毫升/升,即每升基礎培養基包含65毫升的目標碳源。


步驟3:在基礎培養基中分別加入不同種類的氮源后發酵紅曲霉,測量基礎培養基中目標產物的產量,生成第二產量柱形圖,確定發酵培養基的目標氮源。氮源是指能夠為紅曲霉提供氮元素的營養物質,是構成紅曲霉蛋白質、核酸和其他重要含氮化合物的關鍵成分。氮源的種類包括蛋白胨、谷氨酸鈉、酵母粉、黃豆粉。選擇該4種氮源進行實驗獲取數據。除氮源外,在基礎培養基中還要加入等量的目標碳源,在28℃下發酵12天。最高目標產物的產量所對應的氮源為目標氮源。


步驟4:在基礎培養基中分別加入不同濃度的目標氮源后發酵紅曲霉,測量基礎培養基中目標產物的產量,生成第二產量曲線,確定目標氮源的第二目標濃度。最高目標產物的產量所對應的目標氮源的濃度為第二目標濃度。


步驟5:確定影響紅曲霉發酵的至少兩個基礎因子并生成因子集合,根據第一目標濃度的目標碳源和第二目標濃度的目標氮源制備發酵培養基。因子集合包括初始pH、溫度、接種量、溶氧量、培養時間。制備發酵培養基的步驟:在250毫升的三角瓶中裝入80毫升的種子培養液,然后將三角瓶在121℃滅菌30分鐘,最后加入第一目標濃度的目標碳源和第二目標濃度的目標氮源。


步驟6:在發酵培養基中發酵紅曲霉,根據單因素實驗得出基礎因子的高水平值和低水平值,從因子集合中篩選核心因子并生成核心因子集合,確定核心因子集合的組合高水平值。單因素實驗是一種控制因子集合中的一個基礎因子為變量,其余基礎因子保持基準值的實驗。在本實施例中,因子集合中的各因子的基準值為6.0、30℃、5%、80%、12天,初始pH的實驗范圍為[3.0,6.0]、溫度的實驗范圍為[25℃,37℃]、接種量的實驗范圍為[5%,15%]、溶氧量的實驗范圍為[65%,100%]、培養時間的實驗范圍為[0天,16天]。最高目標產物的產量對應的因子變量的值為高水平值,低水平值為小于高水平值的因子變量的值。低水平值有多個,根據實驗需求和因子變量的實驗范圍選擇高水平值附近的一個低水平值。遍歷的選擇因子集合中的一個因子作為因子變量,其余因子保持基準值,設計單因素實驗。


本實施例的初始pH的高水平值為5.0,低水平值為4.0;溫度的高水平值為28℃,低水平值為25℃;接種量的高水平值為10%,低水平值為5%;溶氧量的高水平值為96%,低水平值為65%;培養時間的高水平值為16天,低水平值為10天。通過設計普拉克特-伯曼實驗,從因子集合中篩選核心因子并生成核心因子集合,進行普拉克特-伯曼實驗設計時,另設至少一個空項進行誤差分析,以目標產物的產量為響應值,具體步驟在實施例二中進行說明。通過最陡爬坡實驗,確定核心因子集合的組合高水平值,本實施例的組合高水平值為5%的接種量、95%的溶氧量、14天的培養時間。最陡爬坡實驗是實驗設計中的一種方法,主要用于探索響應值最大所在的區域,這種方法是在普拉克特-伯曼實驗設計之后使用,以識別出對響應值有顯著影響的因素,即核心因子集合,并確定核心因子集合的組合高水平值。


步驟7:控制多組發酵培養基保持核心因子的組合高水平值,發酵培養基進行不同時間的發酵紅曲霉,生成紅曲霉生長曲線、目標產物產量曲線、底物消耗曲線。發酵紅曲霉時,保持核心因子之外的基礎因子處于高水平值。通過高效液相色譜儀測量目標產物的產量,通過生物傳感儀測量剩余底物的含量。

紅曲霉生長曲線


步驟8:擬合紅曲霉生長曲線、目標產物產量曲線、底物消耗曲線,得出紅曲霉生長函數、目標產物產量函數、底物消耗函數。邏輯斯蒂方程是典型的S型曲線,在描述紅曲霉菌體生長方面被廣泛應用,效果較好,因此可以選用邏輯斯蒂方程對紅曲霉生長曲線進行擬合得出紅曲霉生長函數。選用呂德金-皮雷特方程來描述紅曲霉發酵的目標產物的生成規律,對目標產物產量曲線進行擬合得出目標產物產量函數。采用呂德金-皮雷特型方程對底物消耗的過程進行描述,對底物消耗曲線進行擬合的得出底物消耗函數。紅曲霉生長函數


步驟9:根據紅曲霉生長函數得出第一時間,根據目標產物產量函數得出第二時間,根據第一時間、第二時間和底物消耗函數確定發酵培養基的底物添加函數。底物添加函數a(t)=s(t)-s(t+Δt),a為底物添加量,Δt為底物添加周期,Δt=1,t1<t<t2,t1為第一時間,t2為第二時間,第一時間為紅曲霉生長函數的生物量達到最大值時的最小發酵天數,第二時間為目標產物產量函數的目標產物的產量達到最大值時的最小發酵天數。第一時間為6天,第二時間為15天。


步驟10:根據目標碳源、第一目標濃度、目標氮源、第二目標濃度、核心因子的組合高水平值和底物添加函數輸出紅曲霉的發酵參數。本實施例的發酵參數包括甘油濃度65毫升/升、黃豆粉3克/升、5%的接種量、95%的溶氧量、14天的培養時間、底物添加函數a(t)。通過紅曲霉的發酵參數從發酵培養基的組成成分、外界影響因素和底物添加三個方面優化紅曲霉的發酵工藝。


有益效果:本發明通過基礎培養基對紅曲霉進行發酵實驗尋找合適的目標碳源和目標氮源,以及目標碳源的第一目標濃度和目標氮源的第二目標濃度。通過發酵培養基發酵紅曲霉,篩選出核心因子集合,根據核心因子集合、核心因子的高水平值設計最陡爬坡實驗確定核心因子集合的組合高水平值。通過控制發酵培養基的核心因子保持組合高水平值,對紅曲霉進行不同時間的發酵,生成紅曲霉生長曲線、目標產物產量曲線、底物消耗曲線。對所述曲線進行擬合得出紅曲霉生長函數、目標產物產量函數和底物消耗函數。根據紅曲霉生長函數、目標產物產量函數和底物消耗函數確定發酵培養基每天的底物添加函數,保證發酵培養基中的紅曲霉能有足夠的營養物質進行發酵、生產目標產物,同時避免營養物質過多而使紅曲霉進一步繁殖影響目標產物的生產。

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