肺炎克雷伯菌生長曲線及小鼠肺炎模型構(gòu)建
肺炎克雷伯菌是存在于正常人腸道及呼吸道的重要的條件致病菌，它可黏附于機體腔道黏膜表面，分泌多糖基質(zhì)，形成生物被膜。
細(xì)菌形成生物被膜后，常使感染變得難治、易復(fù)發(fā)。由于胞外黏多糖的屏障作用、通過影響宿主免疫功能及細(xì)菌的基因表達等作用，而使其對抗生素產(chǎn)生耐藥。本文將通過肺炎克雷伯菌滴鼻感染小鼠，構(gòu)建肺炎模型進行案例分析，給與頭孢氨芐治療評估藥效。
表1.動物實驗分組及給藥
用接種環(huán)刮取平板上的全部菌落，分別接種到含有5mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150r/min振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6-0.8。將菌液依次稀釋為10的負(fù)一次方，10的負(fù)二次方至10的負(fù)九次方，測定OD600，并分別涂板統(tǒng)計菌落數(shù)，計算OD值與CFU做生長曲線。
菌體培養(yǎng)離心后用無菌的PBS洗滌重懸3次，根據(jù)OD值和生長曲線將菌液調(diào)整至合適的稀釋度、經(jīng)呼吸麻醉后滴鼻感染。
小鼠經(jīng)滴鼻感染后給藥組給與頭孢氨芐治療（15mg/kg，灌胃），每天一次。
D0采集空白血清，攻毒后觀察動物體重及存活率，根據(jù)體重及存活情況暫定感染后于D3，D5每劑量組隨機處死1只，采集血液和肺臟灌洗液測細(xì)菌載量，肺臟取樣做HE。
檢測指標(biāo)：
眼眶取血，靜置1h，室溫離心2500 rcf 15min分離血清，-80攝氏度存儲。
取小鼠全部肺臟，一部分進行細(xì)菌載量測定，另一部分4%PFA固定后進行HE染色。
將菌液依次稀釋為10的負(fù)一次方，10的負(fù)二次方至10的負(fù)九次方，測定OD600，并分別涂板統(tǒng)計菌落數(shù),計算OD值與CFU計算生長曲線。
圖1.肺炎克雷伯菌生長曲線
實驗動物的體重作為間接測定感染及治療效果參考指標(biāo)。研究期間體重測量頻率為1次/天，動物體重的變化趨勢如圖2所示。小鼠經(jīng)滴鼻感染后體重持續(xù)下降，隨著感染細(xì)菌量增加體重下降越明顯，經(jīng)頭孢氨芐治療體重下降趨勢減緩。
圖2.不同組別小鼠體重變化趨勢
肺炎克雷伯菌LD50為6.9*106 CFU/只，滴鼻攻毒后D2-D3小鼠癥狀最明顯，體重下降嚴(yán)重，陸續(xù)出現(xiàn)死亡，小鼠經(jīng)過頭孢氨芐治療后狀況優(yōu)于未治療組；由于菌株毒力較強，攻毒低劑量組存活率高于高劑量組。
圖3.不同組別小鼠生存曲線
小鼠肺臟組織細(xì)菌載量隨著接種量的增加而增加，G4組肺組織細(xì)菌載量為3.12*108，G2組細(xì)菌載量為6.1*108。給與頭孢氨芐治療后細(xì)菌載量明顯下降，G1組細(xì)菌載量為2*108（圖4）。
圖4.不同組別小鼠肺臟組織細(xì)菌載量
圖5：對照組肺臟組織
肺臟組織的被膜結(jié)構(gòu)清晰；肺臟實質(zhì)為肺內(nèi)支氣管各級分支及其終末的大量肺泡，灶性肺泡壁輕度增厚（黑色箭頭），肺泡間隔增寬；各級支氣管結(jié)構(gòu)無明顯異常；少量血管周圍結(jié)締組織排列疏松（橙色箭頭）；少量血管淤血（綠色箭頭）；未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤。
圖6：1*108CFU/只感染組肺臟組織
肺臟組織的被膜結(jié)構(gòu)清晰；肺泡壁薄，大范圍肺泡上皮細(xì)胞壞死（黑色箭頭），胞核溶解，胞質(zhì)嗜酸性增強；肺泡腔內(nèi)廣泛可見以巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞滲出（藍色箭頭），并可見壞死細(xì)胞碎片及少量嗜酸性物散在分布（紅色箭頭），少量肺泡擴張（灰色箭頭），體積增大；大量支氣管及細(xì)支氣管腔內(nèi)可見炎性細(xì)胞滲出及壞死細(xì)胞碎片（橙色箭頭）；此外，細(xì)支氣管及肺泡腔內(nèi)可見大量的藍紫色點狀物細(xì)菌聚集（黃色箭頭）；組織內(nèi)可見大量的出血灶（棕色箭頭），肺泡腔、細(xì)支氣管及血管周圍可見多量的紅細(xì)胞；多見肺泡壁毛細(xì)血管淤血（紫色箭頭）；少量血管淤血（綠色箭頭）。
肺炎克雷伯菌小鼠LD50為6.9*106 CFU/只，滴鼻攻毒后D2-D3小鼠癥狀最明顯，體重下降嚴(yán)重，陸續(xù)出現(xiàn)死亡，小鼠經(jīng)過頭孢氨芐治療后狀況優(yōu)于未治療組；由于菌株毒力較強，攻毒低劑量組存活率高于高劑量組。
小鼠肺部組織HE顯示肺炎克雷伯菌感染肺部，導(dǎo)致以巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞滲出，大量支氣管及細(xì)支氣管腔內(nèi)可見炎性細(xì)胞滲出及壞死細(xì)胞碎片，細(xì)支氣管及肺泡腔內(nèi)可見大量的藍紫色點狀物細(xì)菌聚集。
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