不同鹽度和pH環(huán)境下?嗜水氣單胞菌生長曲線變化
嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)廣泛分布在自然界的淡水和海水中，是原發(fā)性致病菌，可感染多種水生動物，是引起魚類出血性敗血癥的主要病原，是人、獸、魚共患的致病微生物，在水產學界、獸醫(yī)學界和醫(yī)學界受到廣泛重視。
嗜水氣單胞菌嗜溫性、有運動力，為條件致病菌。在14.0~40.5℃水溫范圍內都可生長，最適溫度為28.0~30.0℃。從生產實際接收的病例中分析可推斷其主要通過腸道獲得感染，不過能否感染還取決于菌體對魚腸道組織黏附力的強弱和環(huán)境的適應性，通常具有高黏附力和適應性的嗜水氣單胞菌株才能產生毒性很強的外毒素。
菌外膜蛋白在維持細菌的基本形態(tài)、細菌代謝物質的跨膜運輸及調節(jié)細菌有關物質合成方面起著重要的作用。研究表明細菌外膜蛋白具有良好的免疫原性，不僅可激發(fā)機體的體液免疫，還可誘導細胞介導的免疫應答。
為了更好地預防該菌對水產的影響，從養(yǎng)殖環(huán)境上抑制該菌的生長繁殖，本研究探討該菌的環(huán)境適應性及其外膜蛋白在不同鹽度和pH環(huán)境下的變化，以期為后續(xù)致病機制的研究和蛋白疫苗免疫提供理論基礎。
2結果與分析
2.1生長情況
通過生長曲線（圖1）可以看出，3~6 h為本菌的對數(shù)生長期，6 h后生長趨于平穩(wěn)達到穩(wěn)定期。
圖1致病性嗜水氣單胞菌的生長曲線
2.2對鹽的耐受性
由圖2可知，在15‰與40‰的鹽度下、20‰~30‰鹽度環(huán)境下該菌增長變化差異不顯著，35‰鹽度環(huán)境下較15‰、20‰、25‰和40‰組增長差異顯著，為最適的增長鹽度。
圖2致病性嗜水氣單胞菌對鹽度環(huán)境的耐受性
不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05），相同字母表示差異不顯著（P＞0.05），下同。
2.3耐酸堿性
由圖3可知，pH 2~3的環(huán)境中該菌幾乎不生長，pH=4時增長較為顯著，此時該菌增長緩慢；在堿性環(huán)境中（pH=8、9、10）該菌OD值呈下降趨勢，pH=6時該菌長勢最好，為該菌最適生長的pH環(huán)境。
圖3致病性嗜水氣單胞菌對pH環(huán)境的耐受性
2.4對藥敏紙片的敏感性
由抗生素的抑菌試驗可以發(fā)現(xiàn)該菌對喹諾酮類藥物最為敏感（表1），如依諾沙星、恩諾沙星、氧氟沙星等；對個別氨基糖苷類抗生素較敏感，如慶大霉素和新霉素；對個別香豆素類抗生素和四環(huán)素類藥物中度敏感，如新生霉素和多西環(huán)素；對磺胺類和氯霉素類抗生素具有耐藥性，如磺胺異惡唑和氟苯尼考等。
表1致病性嗜水氣單胞菌的耐藥性
注：“S”為敏感；“I”為中度敏感；“R”為不敏感。
2.5 HRP?黏蛋白測定
選取達到穩(wěn)定期的菌株，這一時期的菌株增長穩(wěn)定，各項理化性質達到最佳峰值。通過HRP-黏蛋白濃度與菌體的黏附作用可以得出最佳吸附值。黏蛋白與菌體存在最佳的吸附效果，根據(jù)所得的標準曲線回歸方程y=1.427 6x－0.021，R2＝0.991 5。依據(jù)標準曲線計算出最佳濃度，最佳的結合黏蛋白質量濃度為0.335 9 mg/mL（圖4）。
圖4菌體與HRP-黏蛋白濃度的黏附效果
2.6蛋白濃度
所得標準曲線的回歸方程：y＝2.246 1x+0.040 4，R2＝0.994 1。依據(jù)標準曲線將外膜蛋白質量濃度調整到0.1 mg/mL進行SDS-PAGE試驗。
2.7蛋白條帶
由圖5可知，不同pH和鹽度環(huán)境下，在35~63 ku均有明顯的條帶變化。將條帶切割送生工檢測，鑒定蛋白。通過生工質譜檢測鑒定，評分最高的蛋白為HSP60（60 ku熱休克蛋白）。
圖5不同pH（A）和鹽度（B）環(huán)境下外膜蛋白的變化
2.8 ExPASy的蛋白分析
通過ExPASy-ProtParam tool分析工具進行分析，該蛋白氨基酸數(shù)為544，分子質量為57 194.87，理論pI為4.87。其帶負電荷的殘基總數(shù)(Asp+Glu)為80，該蛋白為穩(wěn)定蛋白，其不穩(wěn)定指數(shù)為29.31，帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg+Lys)為62；脂肪指數(shù)為98.29，親水性總平均值(GRAVY)為0.014。通過STRING數(shù)據(jù)庫預測其與相關蛋白的相互關聯(lián)，圖6是證據(jù)視圖，蛋白質CH60_AERHH在圖中顯示為groL。
圖6 HSP60與其他蛋白的相互作用
3討論
通過分離鑒定篩選出1株致病性嗜水氣單胞菌，在37℃條件下培養(yǎng)3 h達到對數(shù)生長期，培養(yǎng)6 h后達到穩(wěn)定期。由于海水的溫度可達28℃、鹽度可達25‰以上、pH 7~8，這些條件均適宜致病性嗜水氣單胞菌增殖生長，這也是該病可發(fā)生在海水魚中的原因之一；
腸道中的選擇性屏障可以調節(jié)水和小分子物質的跨膜轉運。致病菌侵入腸道內或者機體免疫機能下降都將導致腸道條件致病菌被激活，發(fā)生腸源性感染。
熱休克蛋白(HSPs)是廣泛存在的一類熱應激蛋白質。小分子熱休克蛋白具有多種功能，包括抗高溫高熱，作為分子伴侶可以有效地防止蛋白聚集，從而對抗正常的細胞死亡，讓細胞數(shù)量達到平衡。當細胞受到外部刺激時，許多基因一般并不表達的小分子熱休克蛋白開始顯著表達，比如高溫高熱刺激。
研究發(fā)現(xiàn)，除了熱刺激外還有許多化學、物理刺激可以激活小分子熱休克蛋白的表達，例如紫外線、機械損傷、射線、氧化劑、酸等。當細菌侵入機體時，HSP60作為外源性抗原可以通過MHCⅡ類分子使T淋巴細胞發(fā)生致敏，同時由于細菌HSP60和動物HSP60有高度同源性，所以會發(fā)生自身免疫。
有研究表明，酵母HSP60因某些應激條件出現(xiàn)功能失活或生理缺失則酵母細胞會停止生長，大量的線粒體基質定位蛋白在HSP60的協(xié)助下仍能夠跨膜轉運到線粒體基質中。
熱休克蛋白提高了細胞的抗應激和耐受能力，它可以幫助變性、不可溶的凝聚蛋白重新恢復天然構象。熱休克蛋白參與不同的生物和免疫反應，在很多免疫治療中可能都起到重要的作用。后期將通過對嗜水氣單胞菌外膜蛋白HSP60的自身免疫作用及以HSP60為基礎的自身免疫方法的研究，為水產通過增強自身免疫抵抗病原菌的侵襲提供了堅實的基礎。
本研究為大黃魚致病性嗜水氣單胞菌防治提供一定依據(jù)，為可持續(xù)健康養(yǎng)殖提供新思路，同時為開發(fā)疫苗免疫增強魚體自身免疫提供理論基礎。
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