菌株雙控制生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)及其應(yīng)用的遺傳穩(wěn)定性（一）
代謝工程和合成生物學(xué)為將細(xì)菌轉(zhuǎn)化為生物工廠，從廉價(jià)的底物中生產(chǎn)有價(jià)值的化合物提供了廣泛的可能性。用于生物生產(chǎn)的微生物工程相當(dāng)于代謝通量從生長(zhǎng)到產(chǎn)品合成的重新定位。這種細(xì)胞資源的重新分配面臨著產(chǎn)量和生產(chǎn)力之間的基本權(quán)衡。產(chǎn)量的增加，即底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的比例，會(huì)增加代謝負(fù)荷，從而降低生長(zhǎng)速率。較低的生長(zhǎng)速率導(dǎo)致較慢的生物量積累，并因此降低生產(chǎn)率，即降低感興趣的化合物的總生產(chǎn)率。
處理這種權(quán)衡的一種廣泛使用的方法是交替生長(zhǎng)和生產(chǎn)階段。沿著這些思路，研究人員在大腸桿菌中開(kāi)發(fā)了一種合成生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)，其中表達(dá)RNA聚合酶兩個(gè)主要亞單位β和β′的操縱子受到異丙基-b-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的嚴(yán)格調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)節(jié)誘導(dǎo)劑的外部濃度，可以開(kāi)啟或關(guān)閉生長(zhǎng)。此外，在生長(zhǎng)停滯后，細(xì)菌能夠從葡萄糖中產(chǎn)生甘油，產(chǎn)量接近理論最大值。
從進(jìn)化的角度來(lái)看，許多合成回路都是脆弱的，因?yàn)閿y帶該回路的宿主菌株被其必須運(yùn)行的環(huán)境反向選擇。這也適用于生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)，即解除RNA聚合酶ββ’亞基編碼基因抑制的自發(fā)突變會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)中的突變細(xì)菌迅速超過(guò)生長(zhǎng)停滯的細(xì)菌群。生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)的設(shè)計(jì)包括防止突變發(fā)生的保護(hù)措施，特別是編碼阻遏物L(fēng)acI的基因的冗余。然而，當(dāng)在大規(guī)模生物反應(yīng)器中進(jìn)行高密度培養(yǎng)的長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵過(guò)程時(shí)，有害的突變體發(fā)生的概率更高，并且這些保護(hù)措施可能是不夠的。在大腸桿菌中，突變率約為每代每核苷酸2×10-10，這意味著在高細(xì)胞密度下，平均幾次細(xì)胞分裂就足以使任何核苷酸突變。
通過(guò)建立進(jìn)一步的冗余，可以控制RNA聚合酶表達(dá)的合成回路的遺傳穩(wěn)定性的進(jìn)一步增加。在這里，研究人員開(kāi)發(fā)了一種菌株，其中RNA聚合酶的另一個(gè)亞單位α被置于用于控制ββ’亞單位表達(dá)的同一lac系統(tǒng)的控制之下。因此，只有編碼α(rpoA)和ββ′(rpoBC)的基因上游的兩個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域同時(shí)突變，才能使RNA聚合酶的表達(dá)控制失效，從而使生長(zhǎng)控制失效。這顯著增加了生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)及其應(yīng)用的遺傳穩(wěn)定性。
研究?jī)?nèi)容：
1.RNA聚合酶表達(dá)雙調(diào)控大腸桿菌菌株的構(gòu)建
圖1生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)的交替設(shè)計(jì)：?jiǎn)慰刂疲⊿C）和雙控制（DC）
研究人員首先將編碼β和β‘亞基的rpoBC基因置于一個(gè)可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制下，來(lái)控制RNA聚合酶的表達(dá)。利用同源重組將天然啟動(dòng)子替換為T(mén)5啟動(dòng)子、兩個(gè)lac操作子和大觀霉素抗性。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子LacI與lac操縱序列結(jié)合，從而阻止RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄rpoBC基因。當(dāng)IPTG結(jié)合時(shí)，LacI與操縱符序列分離，從而緩解了基因的抑制。rpoBC基因也與核糖體基因rplKAJL一起被組織成一個(gè)操縱子。為了避免控制rplKAJL表達(dá)的啟動(dòng)子的通讀轉(zhuǎn)錄，因此在大觀霉素抗性基因的上游添加了一個(gè)強(qiáng)終止子（圖1a）。
使用上述系統(tǒng)，可以通過(guò)IPTG外部控制RNA聚合酶的表達(dá)。當(dāng)在培養(yǎng)基中添加IPTG時(shí)，會(huì)產(chǎn)生ββ‘-亞基，細(xì)菌正常生長(zhǎng)。然而，在沒(méi)有IPTG的情況下，rpoBC基因不被轉(zhuǎn)錄，也沒(méi)有形成新的RNA聚合酶全酶。因此，細(xì)胞產(chǎn)生生物合成功能所需的RNA和蛋白質(zhì)的能力下降，并最終停止生長(zhǎng)。然而，這些細(xì)菌仍然具有代謝活性，可以利用它來(lái)引導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從生長(zhǎng)到產(chǎn)生一種感興趣的化合物。
這種方法的一個(gè)缺點(diǎn)是，LacI基因的突變會(huì)阻止抑制因子與T5啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，在生長(zhǎng)停滯的條件下是非常有益的，因?yàn)橛胸S富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但沒(méi)有IPTG供應(yīng)。攜帶這些突變的細(xì)菌能夠在這些條件下生長(zhǎng)，并將很快超過(guò)培養(yǎng)物。為了使生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)對(duì)突變更穩(wěn)定，因此在染色體上的不同位點(diǎn)上克隆了另外兩個(gè)lacI拷貝（圖1b）。這種冗余降低了由于lacI突變而失去生長(zhǎng)控制的風(fēng)險(xiǎn)。這種策略導(dǎo)致了一個(gè)至少能穩(wěn)定24小時(shí)的系統(tǒng)。
為了滿(mǎn)足這一要求，研究人員進(jìn)一步推進(jìn)了冗余策略，將α-亞基基因置于第二個(gè)相同的T5啟動(dòng)子的控制下。α-亞基由rpoA基因編碼，rpoA基因包含在核糖體基因rpsMKD和rplQ的操縱子中。與rpoBC基因相反，rpoA沒(méi)有一個(gè)單獨(dú)的啟動(dòng)子，并與核糖體基因共轉(zhuǎn)錄。為了避免核糖體基因的表達(dá)受到干擾，研究人員將rpoA克隆到sokA-insKJ-hokA序列中，用氯霉素抗性取代了rpoA的自然拷貝（圖1c，d）。
2.RNA聚合酶表達(dá)的雙重控制導(dǎo)致了一個(gè)功能性的生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)
SC菌株表現(xiàn)出一種開(kāi)關(guān)樣的誘導(dǎo)模式:對(duì)于低濃度的IPTG，菌株不生長(zhǎng)，而高于閾值濃度，菌株的生長(zhǎng)速度與WT菌株大致相同。為驗(yàn)證在DC菌株中實(shí)現(xiàn)的ββ'‐和α‐亞基誘導(dǎo)控制的改進(jìn)設(shè)計(jì)是否保留了這種開(kāi)關(guān)表型。研究人員將SC和DC菌株在M9最小培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，添加0.2%葡萄糖和250μM IPTG，以保證RNA聚合酶的表達(dá)和生長(zhǎng)。將預(yù)培養(yǎng)物洗滌并重新稀釋到相同的培養(yǎng)基中，但添加了不同濃度IPTG，范圍為0至500μM。
在SC應(yīng)變的曲線中，0-20μM的IPTG中，由于預(yù)培養(yǎng)中RNA聚合酶的積累，有一些殘留的生長(zhǎng)，當(dāng)RNA聚合酶被稀釋后停止。然而，吸光度仍然可以忽略不計(jì)。相反，當(dāng)濃度為40μM或更高時(shí)，rpoBC的誘導(dǎo)足以使菌株生長(zhǎng)，其速度與WT菌株相似。為了量化這一觀察結(jié)果，研究人員確定了生長(zhǎng)培養(yǎng)物在指數(shù)中期的生長(zhǎng)速率，并將生長(zhǎng)受阻的菌株的生長(zhǎng)速率設(shè)置為0（圖2c）。該圖清楚地顯示出了SC應(yīng)變?cè)贗PTG閾值濃度附近的開(kāi)關(guān)行為。
DC菌株也表現(xiàn)出一個(gè)開(kāi)關(guān)表型，具有近似相同的開(kāi)關(guān)閾值，盡管在40μM時(shí)，尚未達(dá)到最大的生長(zhǎng)速率（圖2b）。此外，其最大生長(zhǎng)速率低于WT菌株。DC的生長(zhǎng)產(chǎn)量，即限制碳源（0.2%葡萄糖）產(chǎn)生的最大生物量，也低于WT菌株，這與SC菌株的觀察結(jié)果相反（圖2a，b）
圖2單調(diào)控（SC）和雙調(diào)控（DC）菌株的生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)行為
這兩種菌株的不同設(shè)計(jì)可以解釋SC菌株和DC菌株轉(zhuǎn)換表型的差異。對(duì)于高IPTG水平，SC中β‘-亞基的濃度高于WT菌株。因?yàn)閞poB和rpoC以大約相同的速率共轉(zhuǎn)錄和翻譯，這可能也適用于β-亞基。因此，在SC菌株中，功能核心RNA聚合酶的濃度將受到高IPTG水平下（自然表達(dá)的）α-亞基的濃度的限制。然而，在DC菌株中，rpoA也是從T5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄出來(lái)的（并且與rpoB具有相同的核糖體結(jié)合位點(diǎn)）。考慮到ω-亞基是非必需的，因此，對(duì)于高水平的IPTG，DC中功能核心RNA聚合酶的濃度高于SC中。這可能導(dǎo)致不必要的更高的轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致適應(yīng)度成本，從而導(dǎo)致生長(zhǎng)缺陷。
菌株雙控制生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)及其應(yīng)用的遺傳穩(wěn)定性（一）
菌株雙控制生長(zhǎng)開(kāi)關(guān)及其應(yīng)用的遺傳穩(wěn)定性（二）
相關(guān)新聞推薦
2、327株不同種類(lèi)鏈球菌的體外藥敏試驗(yàn)檢測(cè)方法（二）
3、秸稈生物炭對(duì)土壤功能微生物生長(zhǎng)及吸附的影響