HMO高利用率菌株篩選方法及生長(zhǎng)曲線繪制
人乳中的低聚糖(HMO)作為一種重要的益生元，對(duì)嬰兒的健康有著獨(dú)特的作用。2’-鹽藻基乳糖(2’-FL)和乳糖-N-新四糖(LNnT)作為兩種豐富的HMO，由于其對(duì)嬰幼兒的獨(dú)特益處和巨大的商業(yè)價(jià)值而越來(lái)越受到人們的關(guān)注。它們對(duì)嬰兒具有優(yōu)越的益生元特性，其他健康影響也得到了證實(shí)，包括免疫調(diào)節(jié)、抗炎、預(yù)防壞死性小腸結(jié)腸炎、抗粘附抗菌劑、抗病毒活性和促進(jìn)腸上皮細(xì)胞成熟。安全性評(píng)估和臨床試驗(yàn)表明，2’-FL和LNnT對(duì)嬰兒是安全和耐受性良好的，已經(jīng)在商業(yè)上作為嬰兒配方奶粉的功能性成分添加。
嬰兒的腸道微生物群通常富含雙歧桿菌屬，在不同的腸道微生物中，嬰兒腸道相關(guān)雙歧桿菌可以有效同化HMO。研究表明，HMO同化能力在不同的雙歧桿菌種類和菌株之間有顯著差異。因此，要真正最大限度地發(fā)揮益生元和益生菌補(bǔ)充劑在商品化配方中的作用，需要更詳細(xì)地了解益生菌的HMO同化行為。
應(yīng)用Biosense全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀監(jiān)測(cè)HMO利用菌株的生長(zhǎng)過(guò)程，篩選的長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種dipro-F，dipro-15和dipro-105能夠高效利用HMO。
1)分別將待測(cè)多株雙歧桿菌活化得到種子液，然后將種子液離心后PBS洗滌重懸后得到細(xì)菌懸液，然后將細(xì)菌懸液1％-10％的體積百分比加入到含有溴酚甲紫的無(wú)碳源MRS+培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以2’-FL和LNnT分別作為唯一碳源進(jìn)行添加，然后以葡萄糖為陽(yáng)性對(duì)照，以水為陰性對(duì)照，觀察培養(yǎng)基顏色，菌株生長(zhǎng)，則培養(yǎng)基顏色變黃，反之培養(yǎng)基顏色維持紫色，將獲得的培養(yǎng)基顏色變黃對(duì)應(yīng)的菌株初步判斷為能夠同時(shí)利用2’-FL和LNnT的菌株；
圖為8株菌在三種碳源下的生長(zhǎng)曲線；
圖葡萄糖為碳源時(shí)，三株HMO利用菌株的生長(zhǎng)曲線；
圖以2’-FL為碳源時(shí)，三株HMO利用菌株的生長(zhǎng)曲線；
圖以LNnt為碳源時(shí)，三株HMO利用菌株的生長(zhǎng)曲線。
2)使用步驟
得到的菌株分別制備細(xì)菌懸液，將細(xì)菌懸液接種到含有無(wú)碳源MRS+培養(yǎng)基中，以2’-FL和LNnT分別作為唯一碳源進(jìn)行添加，然后以葡萄糖為陽(yáng)性對(duì)照，以水為陰性對(duì)照，根據(jù)取樣時(shí)間次數(shù)，配置多個(gè)平行培養(yǎng)的菌，每隔幾個(gè)小時(shí)測(cè)定OD600，繪制生長(zhǎng)曲線，根據(jù)生長(zhǎng)曲線計(jì)算曲線下面積AUC，根據(jù)AUC判斷測(cè)試的不同菌株對(duì)不同碳源的利用率；AUC的公式如下：
其中，t為時(shí)間，0＜i＜48h，OD代表OD600值，當(dāng)測(cè)試的菌株的AUC值大于標(biāo)準(zhǔn)菌株(M16V菌株)的10倍以上，即為HMO高利用率菌株。
其中，雙歧桿菌包含短雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種、兩歧雙歧桿菌、假小鏈雙歧桿菌、短雙歧桿菌和動(dòng)物雙歧桿菌中的一種或多種。
其中，步驟1)無(wú)碳源MRS+培養(yǎng)基是在無(wú)碳源MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為0.5g/L半胱氨酸。
其中，無(wú)碳源MRS培養(yǎng)基包括如下組成：蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉膏10.0g、無(wú)水乙酸鈉5.0g、無(wú)水磷酸氫二鉀2.0g、檸檬酸氫二銨2.0g、七水硫酸鎂0.58g、四水硫酸錳0.25g、吐溫-80 0.1mL，加蒸餾水至1000mL，調(diào)整pH值至6.2～6.4，121℃滅菌15分鐘。
其中，步驟1)和步驟2)中的葡萄糖、2’-FL和LNnT工作濃度均為2-20g/L。作為優(yōu)選，工作濃度為10g/L。
其中，步驟1)中的細(xì)菌懸液的濃度為OD600＝0.5-5。
其中，步驟2)細(xì)菌懸液的濃度為OD600＝0.5-5。
基于上述篩選方法得到的高HMO利用率菌株。
結(jié)論：這種HMO高利用率菌株的高通量篩選方法，簡(jiǎn)單快捷，篩選一目了然，可以用于HMO為唯一碳源的利用率篩選，也可以用于其他碳源作為唯一碳源的利用率篩選；這種HMO利用率定量篩選的方法，避免了厭氧菌在生長(zhǎng)曲線測(cè)定過(guò)程中反復(fù)取放引起氧氣后對(duì)菌株生長(zhǎng)造成的影響，為嚴(yán)格厭氧菌的生長(zhǎng)曲線測(cè)定提供了一種可行的實(shí)驗(yàn)方案。篩選的長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種dipro-F，dipro-15和dipro-105能夠高效利用HMO，相比市場(chǎng)所售的嬰幼兒可食用名單菌株具有更優(yōu)的HMO利用效率，經(jīng)過(guò)全基因組測(cè)序確定了HMO利用機(jī)制，菌株經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證不存在安全隱患。
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