貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株生長曲線測定及抑菌性能分析
浙江國際海運職業技術學院海洋旅游學院朱亞珠和寧波大學食品與藥學學院夏率博，陳琳，劉洋，吳祖芳，翁佩芳從自然發酵海洋魚醬油中分離得到了一株具有多種蛋白酶活性與糖酶活性的貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株，為探究貝萊斯芽孢桿菌SW5的抑菌特性，研究了SW5菌株的生長及生理生化特性，驗證了SW5菌株發酵上清液對食品中多種常見病原菌的抑制能力；并利用液相色譜-質譜聯用技術鑒定了其中的抑菌物質。結果表明：菌株SW5在35℃、pH值5時生長最快，對于亞胺培南、頭孢曲松等β-內酰胺類抗生素敏感。菌株SW5的發酵上清液具有明顯的抑菌活性，上清液經過濃縮后抑菌效果顯著增強。TOF-MS分析表明，發酵上清液中含有的抑菌物質為表面活性素、山茱萸苷A、氨基糖苷類抗生素慶大霉素與異帕米星、鏈霉菌素類抗生素達福普丁。研究結果以期為菌株SW5的進一步開發利用提供一定的理論基礎。
芽孢桿菌是廣泛存在于環境中的益生菌之一，在增強機體抗氧化能力，提高免疫力和改善生產性能等方面具有良好的效果[1]。貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)作為芽孢桿菌的一個新種，具有植物促生長、生物防治、制備生物修復劑及產生多種酶和抗菌物質等功能[2]，其中的抗氧化性與具有的載體物質胞外多糖[3]和活性肽[4]有關，可作為一種理想的微生物源抗氧化劑。全基因圖譜分析顯示[5-6]，B.velezensis基因組中含有srfAA、srfAB、ituC、bmyB、bioA及fen等多種脂肽類抗生素相關基因，且含有非核糖體多肽合成酶(NRPSs)基因簇，可指導合成多種常見的、具有廣譜抑真菌活性的脂肽，如表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)、芬薺素(fengycin)等，這類脂肽類物質能夠對真菌類植物病原體產生明顯的拮抗作用[7-8]。B.velezensis對白菜黑斑病菌[9]、番茄灰霉病菌[10]、小麥赤霉病菌及小麥全蝕病菌[11]等多種植物病原菌具有拮抗作用，因此在農業上有作為生物抑制劑的潛能[12]。這些特性在食品行業中也具有一定的應用潛力，但鮮有報道。本團隊前期研究中，從自然發酵海洋魚醬油樣品中分離得到了一株貝萊斯芽孢桿菌SW5(Bacillus velezensis SW5，以下簡稱SW5)菌株，具有較強的蛋白酶活性和較好的水解海洋魚類蛋白的特性[13]。本研究進一步對菌株SW5的生長特性、生理生化特性及抑菌性能進行分析，并分離純化和初步鑒定其發酵產生的抑菌物質，為SW5菌株在海洋蛋白質資源深度利用、食品保鮮與安全等方面的應用奠定理論基礎。
1材料與方法
1.1材料與試劑
貝萊斯芽孢桿菌SW5及實驗菌株(鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌、奇異變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌)，寧波大學食品生物技術實驗室保藏。
HCl、NaOH等(分析純)及LB、TSB、NB培養基，上海國藥集團化學試劑有限公司。
1.2儀器與設備
SW-CJ-2D型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司;LDZX-40BⅠ型立式蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠;5804R型高速大容量冷凍離心機，德國Eppendorf公司;QY-2102C型全溫振蕩培養箱，寧波江南儀器廠。
1.3實驗方法
1.3.1培養基配制
MOLP培養基[14](mg/L)：蛋白胨30 000、蔗糖20 000、酵母提取物7 000、KH2PO4 1 900、CuSO4 0.001、FeCl3·6H2O 0.005、Na2MoO4 0.004、KI 0.002、MnSO4·H2O 3.6、MgSO4 450、ZnSO4·7H2O 0.14、H3BO3 0.01、C6H8O7 10，pH值7.0。LB固體培養基(g/L)：NaCl 10、胰蛋白胨10、酵母提取物5、瓊脂15。
1.3.2不同環境因素對菌株SW5生長影響的測定
在LB培養基中接種2%SW5菌株，30℃、200 r/min條件下培養3 d，分別測定不同溫度(5、10、15、20、25、30、35、40、45、50℃)、pH值(3、4、5、6、7、8、9、10、11)、NaCl質量濃度(0、5、10、15、20、25、30 g/mL)對細胞生長的影響。細胞生物量的測定方法：分光光度計測定600 nm處吸光度，根據吸光度大小判斷生長狀態，每個實驗平行重復3次。
1.3.3菌株SW5生長曲線的測定
將菌株SW5種子液(OD600約為1)，按2%接種量接種到含有50 mL LB培養基的三角燒瓶內，在不同時間取樣，測定其在600 nm處的吸光度，然后以OD值為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制生長曲線。
1.3.4菌株SW5的抗生素抗性測定
將SW5菌株按2%接種量接種于TSA平板上，在平板中央打孔，加入一定濃度的EUCAST推薦的抗生素，在37℃培養24 h，測量透明圈直徑，直徑越大說明其對抗生素越敏感。
1.3.5菌株SW5發酵上清液的抑菌特性測定
選取食品中常見的8種病原菌(鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌、奇異變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌)為指示菌，取1 mL新鮮菌液加入100 mL的NB固體培養基中，迅速倒入培養皿中，作為指示菌平板。并在平板上用無菌打孔器打孔備用。取活化好的SW5菌株，按3%的接種量接種于MOLP培養基，在37℃、200 r/min的恒溫培養箱培養24 h。8 000 r/min離心10 min，得到發酵上清液。取50μL發酵上清液加入指示菌平板的孔中，37℃下培養24 h，記錄抑菌圈直徑。
1.3.6濃縮發酵液抑菌活性的測定
在20 mL發酵上清液中加入10 mL的正丁醇，搖勻后離心，抽出有機相后再加入相同體積的正丁醇，重復抽提3次，得到30 mL有機相抽提液。將抽提液進行冷凍干燥，完全凍干后再加入2 mL無菌水溶解，得到濃縮15倍的發酵上清液。按1.3.5節方法測定發酵上清液的抑菌活性。
1.3.7發酵液抑菌物質鑒定
以濃縮后發酵上清液為原料，體積分數10%甲醇為溶劑，采用UHPLC-Q Exactive系統，鑒別出其中的抑菌物質[7]。色譜條件：色譜柱BEHC18(100 mm×2.1 mm，1.7μm)；流動相A為水(含體積分數0.1%甲酸)，流動相B為乙腈-異丙醇(體積比1∶1)(含0.1%甲酸)；流速0.40 mL/min，進樣量10μL，柱溫40℃。原始數據用代謝組學處理軟件Progenesis QI(美國Waters Corporation)進行搜庫鑒定，數據庫來源為http:∥www.hmdb.ca。
2結果與分析
2.1貝萊斯芽孢桿菌SW5的菌落形態分析
將貝萊斯芽孢桿菌SW5接種在LB固體培養基上，觀察其菌落形態，發現SW5菌株在LB培養基上的菌落形態為圓形或橢圓形，一般較大，顏色為不透明灰白色，表面有皺褶，菌落中心有凸起，該結果與鐘麗娟等[15]分離的貝萊斯芽孢桿菌菌落形態類似。
2.2菌株SW5的生長曲線分析
貝萊斯芽孢桿菌SW5的生長曲線如圖1。由圖1可知，接種貝萊斯芽孢桿菌SW5后，延遲期為0～2 h，此時菌株生長緩慢；對數生長期為2～14 h，此時菌體數明顯增多，其中培養至第9 h時，其生長速率達到最大；穩定期為16～26 h，菌體數不再增加，26 h時菌體的OD600值達到最大；最后在26 h后進入衰亡期，菌體數量開始下降。
圖1貝萊斯芽孢桿菌SW5的生長曲線
2.3菌株SW5的生理生化特性分析
2.3.1不同環境因素對菌株SW5生長的影響
菌株SW5在不同溫度下的細胞生長情況如圖2。結果表明：菌株在16～50℃均可生長，溫度大于16℃時，溫度升高生長速度加快，最適生長溫度為35℃。pH值對菌株SW5生長的影響如圖3。從圖3可以看出，pH值為3時細胞不可生長，pH值4～9時均可生長，最適生長pH值為5。不同NaCl質量濃度下的細胞生長情況如圖4。結果表明：在質量濃度0～20 g/100 mL均可生長，0～5 g/100 mL時的生長速度呈上升趨勢，5～20 g/100 mL時生長速度呈下降趨勢。
2.3.2菌株SW5抗生素抗性結果分析
菌株SW5對抗生素抗性實驗結果如圖5。
AMP：氨芐西林，GEN：慶大霉素，KAN：卡那霉素，STR：鏈霉素，NEO：新霉素，TET：四環霉素，ERY：紅霉素，CIP：環丙沙星，CLI：克林霉素，VAN：萬古霉素，RIF：利福霉素，CHL：氯霉素，TRI：甲氧芐啶，LIN：利奈唑胺，QUI：達福普丁，PB：多黏菌素B，CTR：頭孢曲松，IMI：亞胺培南，CAZ：頭孢他啶。
SW5菌株對β-內酰胺類抗生素，如頭孢曲松、亞胺培南，以及氯霉素表現得較為敏感；而對多粘菌素B與克林霉素則體現出較強的耐藥性。張小波等[16]獲得了一株鴨源貝萊斯芽孢桿菌GZZY2019，藥敏實驗顯示該菌對紅霉素、環丙沙星、復方新諾明等15種藥物敏感，對丁胺卡那、哌拉西林、四環素3種藥物中敏，對多粘菌素B、苯唑西林等6種藥物耐藥。表明貝萊斯芽孢菌株對多數抗生素表現為敏感，而對多粘菌素B等少數抗生素表現為耐藥，這種特性為其在食品工業生產中的應用創造了條件與基礎。
2.4菌株SW5的抑菌活性及抗菌成分分析
菌株SW5發酵上清液對幾種常見病原菌的抑菌活性如何？結果表明：菌株經過MOLP培養基的發酵，其上清液對于福氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌、弗氏檸檬酸桿菌和大腸埃希氏菌的生長均表現出一定的抑制作用。發酵上清液濃縮15倍后，對于福氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、奇異變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌和大腸埃希氏菌的抑菌性增強，其中弗氏檸檬酸桿菌、大腸埃希氏菌的抑菌效果變化最為顯著；而對蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌來說，發酵液濃縮后抑菌性稍有減弱。整體來說，菌株SW5的發酵液對于福氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌、弗氏檸檬酸桿菌和大腸埃希氏菌均具有較為顯著的抑菌效果，SW5菌株可作為今后潛在的益生菌應用菌株[17]。
指示菌依次為1.福氏志賀氏菌，2.鼠傷寒沙門氏菌，3.枯草芽孢桿菌，4.蠟樣芽胞桿菌,5.奇異變形桿菌,6.金黃色葡萄球菌，7.弗氏檸檬酸桿菌，8.大腸埃希氏菌。
為進一步探究SW5菌株MOLP培養基抗菌特性的原因，以濃縮后的發酵液樣品為研究對象，通過質譜分析法檢測其抗菌成分，發酵液質譜檢測的總離子色譜結果。該檢測條件下，峰形良好，分布相對均勻。
四極飛行時間質譜分析并結合代謝組學軟件和搜庫鑒定等綜合分析表明：m/z 1 036.69處的吸收峰分子式為C53H93N7O13，對應表面活性素；m/z 860.42處的吸收峰分子式為C21H43N5O7，對應莫西霉素、大環內脂類抗生素；m/z 655.31處的吸收峰分子式為C34H50N4O9S，為達福普汀，屬于鏈霉菌素類抗生素；m/z 557.27處的吸收峰分子式為C29H42O9，為山茱萸苷A；m/z 608.25處的吸收峰分子式為C22H43N5O12，為異帕米星，屬于氨基糖苷類抗生素。
菌株SW5發酵液的成分檢測表明：發酵液中共檢測到5種不同性質的典型抗菌活性成分，印證了實驗菌發酵上清液抑菌實驗結果。細菌素是貝萊斯芽孢桿菌產生的優勢抑菌物質，張海林等[18]純化出了一種細菌素，分子質量約為10 kDa，能夠抵抗蛋白酶K、胃蛋白酶等多種蛋白酶水解，且對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真菌均有較強的抑制能力。在常見細菌或放線菌產生的抗菌物質研究中已有較多報道，如在假單胞菌20#-5菌株[19]、海洋放線菌B5[20]、巨大芽孢桿菌L2[21]、枯草芽孢桿菌SB1[22]等菌株的代謝產物中找到了抑菌物質，并對它們的抑菌效果進行廣泛的探索。而作為一種具有特殊蛋白酶活性多樣性與較高蛋白酶活力的SW5菌株[23]，同時兼備產生多種具有抗菌活性的次級代謝產物的能力，進一步說明了貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株具有的復雜代謝體系及存在多種酶活性，從而賦予SW5菌株多重生物學性能。SW5菌株在食品工業的進一步開發與實際應用還有待進一步的研究。
3、結論
貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株，對數生長周期較長(12 h)，在多種培養基中均能以較快速度生長，且在16～50℃、pH值4～9、NaCl質量濃度為0～20g/100 mL可生長。SW5菌株發酵上清液對福氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌、弗氏檸檬酸桿菌和大腸埃希氏菌具有較強的抑菌作用，其發酵上清液中含有多種氨基糖苷類抗生素，如表面活性素、莫西霉素和異帕米星等，從而對多種病原菌產生抑制作用。
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