改善不可培養微生物可培養效率的方法有哪幾種
2、改善不可培養微生物可培養效率的方法
2.1分散群體微生物
一種方法是在固體培養基上重復劃線，目的是將微生物從群落中分離出來;另一種是在液體培養基上進行一系列重復的稀釋來分離細胞。通過這些方法已經純培養出許多種類微生物，而這些種類所屬的門類沒有或者只有很少代表物種。然而用這些分離方法培養出的種類一般是生長迅速的微生物。
2.2常規培養方法的改進
2.2.1培養基的改善①添加非傳統的碳源、電子供體與受體:2001年Uphoff等將北海的海水樣品在添加了多種不同碳源和復雜化合物的培養基上發現，它比僅含有一種碳源培養基上生長的微生物種類和數量都多。單一碳源分離的菌種幾乎完全屬于變形菌，而在復合的培養基上則分離到4種其他門類的代表物種。2005年Kopke等在培養基中加入多樣的電子受體和碳源從地下煤沉淀物中分離出新種類的微生物。最近，由特殊的原核生物生態群落催化的新還原產物也被用于豐富傳統培養基的類型，并且發現了新的種類;②采用低濃度營養成分培養基或者加入具有毒性氧降解能力的物質:高濃度營養成分的培養方法由于產生毒性氧物質導致所培養的微生物數量和種類都減少，Aagot發現在低濃度營養基質的培養基上培養的微生物較多，但是營養成分濃度過低也使微生物數量下降。減少毒性氧物質的產生也是提高微生物可培養性的一個有利方法。增加多聚物作為碳源，因為多聚物只有被分解成小分子物質才能被利用，這樣微生物在短時間內不會受到毒害作用，有效地減緩了受毒害的速度。減少培養環境中的氧分壓也可以減弱由充足的氧氣而導致毒性氧的傷害。同時，在培養過程中添加過氧化氫酶、丙酮酸鈉、α-酮戊二酸、二硫代二丙酸等具有毒性氧降解能力的物質也可以大大提高微生物可培養性;③增加信號分子來維持微生物之間的相互作用:氮酰高絲氨酸內酯可以有效地提高微生物可培養性，基于這個發現，用于多種基因調控的信號分子cAMP相對于氮酰高絲氨酸內酯更能夠促使微生物的生長，提高了微生物的可培養性。有些細菌例如藤黃微球菌可以分泌一種促進復活因子能夠有效地恢復處于休眠期的革蘭陽性菌的活性;④添加酶、抑制細菌生長的抗生素或者其他抑制劑:添加酶來培養一些產生活性氧的物種，添加某種抑制劑來抑制不希望生長的微生物，例如引入抗生素作為一種新型的能源抑制其他細菌的生長;⑤其他類型凝固劑代替常用的瓊脂:常規的培養基中用瓊脂作為凝固劑，但是它對某些微生物具有一定程度的毒害作用，降低了可培養的微生物數量及種類。采用古蘭糖膠，對微生物沒有毒害作用，而且凝固效果比瓊脂更好。
2.2.2培養條件的改變延長培養時間、降低接種量濃度都可以培養出不可培養微生物。有些微生物屬于寡營養菌，比如在合適的培養基上培養時間延長至3個月，就可長成肉眼可見的菌落，但是培養時間不能無限延長，培養時間越長，對微生物培養環境的無菌要求就越高。降低接種量濃度也能夠使活菌數增加，這種菌并不因為接種量的降低影響它們群落的形成。
2.3模擬自然生存環境
目前，2種新穎的自制培養儀器已經發展成熟，分別是擴散盒培養和含有有機或無機物質的原位群體載體培養。擴散盒由一個濾膜組成，它只允許培養環境中的化學物質和低分子量產物的通過而限制細胞通過，化學物質穿過薄膜與周圍環境因子交換，可保證微生物群落間作用的存在，提高微生物可培養性。土壤、海洋、活性淤泥都可以在擴散盒中培養出不可培養微生物。原位群體載體培養能夠有效地克服原核生物黏附在固體表面導致的生長限制，很多文獻內已經描述了不同載體的自然生態系統，例如陶瓷、鈦裝置、多孔無機基板、聚氨酯泡沫塑料等載體。包有選擇性底物的原位集合物也可以有效地培養出目的微生物。此外，有些特殊裝置僅模擬一個或者幾個重要的物化因素來培養新的微生物。2009年Zeng等模擬高壓環境從最深的高溫噴火口分離出嗜高壓和高溫的古生菌。還有一種是流動裝置，可以在自然環境原位溫度、壓力和液體流動的條件下連續培養，成功模擬深海環境中液體化學成分的變化。2007年Houghton等利用這種裝置培養出新的微生物。
2.4微生物群體培養
自然環境中微生物之間有些是通過交換代謝產物或者特異信號分子進行直接的細胞交流，有些是競爭有限的生存環境，有些是共同利用微量元素(如維生素)和螯合劑，因此單一的微生物培養不能完成復雜的細胞間相互交流。2個典型的群體培養的例子是多細胞培養裝置和生物膜，都可以實施單個物種培養不可能實現的多功能培養。復雜有機物的纖維素降解或甲烷轉換就是利用多細胞裝置實現的。此外，小部分共生的微生物可以在實驗培養基上添加一些微量元素、共底物等可以培養出來。群體培養能夠有效地培養出共生和互生微生物。利用透析膜反應器的群體培養方法已經成功的從厭氧淤泥中培養出厭氧嗜熱的降解谷氨酸的微生物。
2.5高通量培養
為了從自然環境中篩選出新的生物化學分子和酶類，發展了不依賴培養基的高通量培養方法。1993年Button提出稀釋培養法，即將微生物群體稀釋至痕量時(1～5個細胞/mL)，寡營養微生物可以不受其他優勢微生物的干擾，因而可以被培養出來。隨后，Connon采用稀釋培養法將微生物樣品稀釋至痕量后，采用微量細胞培養板和熒光原位雜交技術(FISH)分離培養并檢測出許多微生物，這種方法不僅能有效提高微生物的可培養性，還可在短期內檢測出目標培養物，并進行大量的培養，提高工作效率。2005年Zengler等提出細胞包囊法，將微生物樣品先進行稀釋，然后乳化，部分微生物形成了僅含單個細胞的膠狀微滴，隨后將其裝入層析柱內，讓培養液連續通過層析柱進行流態培養。這種方法已從不同樣品中分離出多種細菌和真菌。2007年Ingham等提出多孔微生物培養芯片，它是由一種獨特的多孔陶瓷做成，被分割成數千個小室，在小室中進行獨立的微生物培養，營養分子可以通過多孔膜四處擴散維持微生物的生長。
到目前為止，不可培養微生物的培養方法仍然存在一定的局限性。這主要是由于缺乏對微生物的多樣性、生存環境以及在生物進化中地位的認識，也由于實驗室中無法設計微生物生長的原位環境實現群體培養。因此，必須全面理解微生物生理適應性與群體行為，發展和革新培養技術，改變微生物培養方式，設計盡可能接近微生物生活的自然環境，培養出更多的“不可培養微生物”，從中發現新的酶類和化合物，使其應用于制藥業、農業、化工業等領域。
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