DAPI熒光染色計數法：不同保藏方式時間對海洋微型底棲生物計數結果的影響——摘要、材料與方法
DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole,4′,6-聯脒-2-苯基吲哚)是一種靈敏度高、特異性強的熒光染料,對細胞核及染色體有很好的染色效果。它可與DNA的A-T堿基結合形成DAPI-DNA復合物,該復合物在紫外激發光(365nm)下會發出藍色熒光。而福爾馬林固定的樣品經DAPI染色時,甲醛可誘發蛋白質中的芳香乙胺基團轉化為熒光色團,從而使細胞質熒光較強,由此可見整個細胞的輪廓。此外,細胞內的色素體在綠色激發光下發出紅色熒光,可計數自養鞭毛蟲。由此,DAPI不僅用于細菌計數,也可用于藍細菌、硅藻、自養和異養小鞭毛蟲及纖毛蟲等微型底棲生物計數。結合復染劑Evans Blue的使用,可使染色后的細胞更容易辨認。
樣品的保藏方式及保存時間是影響DAPI熒光計數效能的重要因素。對海洋浮游細菌及鞭毛蟲的研究發現,固定后的樣品隨著保藏時間延長,可造成數量低估。Daley等、Sherr等及Kepner等發現經福爾馬林固定的浮游樣品于5℃下避光保存1～3周后,對細菌的計數結果無差異。Porter等報道福爾馬林固定的浮游樣品經DAPI染色后封片,4℃下保存24周對細菌的計數結果無差異。但Hyun等報道經福爾馬林固定后的浮游樣品,貯藏于樣品瓶的計數結果優于封片保存的。Turley等用戊二醛固定浮游樣品并經常溫避光保藏,40天后發現對細菌的計數數量平均減少了39%,而經DAPI染色封片并冷凍保存70 d的細菌計數則無影響。而Pomroy發現經過Lugol’s液固定的浮游樣品在室溫避光保存4年未造成對細菌數量的低估,對鞭毛蟲可保存10年甚至更長而無數量變化。但是,上述研究均源自浮游樣品,對于底棲樣品則缺少系統的研究。僅Hamels等報道沉積物中的鞭毛蟲經DAPI染色封片后可冷凍避光保存1個月,而經Percoll液提取后的鞭毛蟲經同樣處理可保存2個月。
由于細菌及原生生物因可附著于其他生物體和/或沉積物顆粒表面(如“海雪”),若不加處理直接以DAPI進行熒光計數,可對其數量乃重要性造成不同程度的低估。目前最為有效的做法是首先利用超聲波等設備將底棲生物與沉積物分散開,然后再行染色計數。但在野外尤其是海上取樣時,因取樣站位多、時間緊、超聲波分散儀及離心設備等現場無法使用,將樣品進行保藏(冷凍或冷藏)后帶回室內分析是較為可行的方法。保藏方式對于無細胞壁的原生生物尤為重要,如在冷凍保藏的凍融過程中,可因細胞膜的破裂而無法準確計數。此外,出海采集常涉及大量樣品,樣品分析完成常需數周甚至數月。因此,測試不同保藏方式和保存時間對沉積物樣品定量分析的影響,是對數量進行準確估算的重要環節。
作者采用DAPI熒光染色計數法對海洋沉積物樣品中的細菌、藍細菌、自養小鞭毛蟲(PNF)和異養小鞭毛蟲(HNF)及硅藻進行了冷藏與冷凍兩種保藏方式的比較分析,同時比較研究了不同保藏時間(1個月和4個月)對這些微型底棲生物計數結果的影響。
1材料與方法
1.1研究站位和樣品采集
用內徑1.6 cm的采樣管(注射器改造),從未受擾動的0.1 m2改進型Gray-Ohara箱式采泥器中,隨機采集5 cm長芯樣4個,每個芯樣按0～2 cm、2～5 cm分層移入50 mL離心管中,加入經濾膜(孔徑0.22μm)過濾的海水配制的2.5%甲醛溶液分別至20 mL和30 mL進行固定。每個重復各取10 mL后合并共計40 mL,一份于4℃避光冷藏保存,一份放置在冰柜-20℃避光冷凍保存。
冷凍和冷藏對比實驗選取2007年7月采集自黃海的編號為3205(32°N,124.5°E)、3403(33.5°N,123°E)、4018(33°N,122.5°E)三個站位的0～2 cm分層樣品;保存時間實驗選取2008年開放共享航次編號為3400-8(34°N,124°E)、3800-1(38°N,121.7°E)兩個站位的0～2 cm、2～5 cm分層的樣品(圖1)。沉積物粒度分析采用Cilas(940L)型激光粒度儀進行測定。其他環境資料來自溫鹽深測定儀(CTD)現場測定。
圖1黃海采樣站位
1.2樣品分析方法
取適量樣品(約2mL)加入焦磷酸四鈉(f.c.1 mmol/L),常溫避光培育15～30 min。經JY92-II超聲波分散處理180 s(振幅109μm,50 W,6 mm Microtip),為避免樣品過熱,每超聲破碎處理45 s,冷卻1 min。取分樣后,根據鏡檢樣品中生物的密度,調節至適當的稀釋倍率(細菌以每個視野20～30個為宜,鞭毛蟲以沉積物不遮擋生物為宜),加入DAPI(f.c.5 mg/L)和復染劑Evans Blue(f.c.10-6g/mL),低溫避光染色10 min。染色樣品經Sartorius真空過濾系統濃縮過濾到黑混合纖維素膜上。封片后置于Zeiss Axioskop 2 plus HBO 100熒光顯微鏡油鏡下鏡檢計數。細菌的計數在紫外光激發(BP 365/12,FT 395,LP 397)下,每片隨機計數20～40個視野,總計500個左右。鞭毛蟲的計數根據其最長粒徑劃分為2～5μm,5～10μm,＞10μm三個粒級,先在紫外激發光下每片隨機計數50個視野(此為鞭毛蟲總數),后轉換至綠色激發光(BP 546/12,FT 580,LP 59)下,每片快速隨機計數50個視野(為自養小鞭毛蟲(PNF)總數)。異養小鞭毛蟲(HNF)的數目為鞭毛蟲總數與自養小鞭毛蟲數目的差值。根據視野面積以及樣品稀釋倍率換算各生物類群的最終豐度。微型底棲生物豐度的計算按如下公式：
A=(N/Sf)SD/V
其中,A為豐度(個/mL);N為各視野平均數(個);Sf為1000×下顯微鏡視野面積(cm2);S為濾膜實際過濾面積(cm2);D為稀釋倍數;V為染色用的樣品體積(mL)。
文中采用如下縮寫：自養小鞭毛蟲PNF(2～5μm)、PNF(5～10μm)、PNF(＞10μm);異養小鞭毛蟲HNF(2～5μm)、HNF(5～10μm)、HNF(＞10μm)。
1.3數據統計分析
采用SPSS 15.0統計軟件進行分析,將沉積物中各類群豐度的不同處理進行T-test檢驗。為使數據正態分布,將原始數據經過log轉化處理。
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