草魚呼腸孤病毒培養(yǎng)與滴度測定、及在草魚、CIK細(xì)胞上的生長特性研究（三）
2.2 GCRV 873株在CIK細(xì)胞中的生長特性
GCRV 873株吸附CIK細(xì)胞1 h后，分別在0、2、4、8、10、12、24、36、48、72 h收取細(xì)胞病毒液。對各個(gè)時(shí)間點(diǎn)病毒滴度及RNA水平進(jìn)行檢測（圖3），并通過顯微鏡觀察不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞病變情況（圖4）。由圖3可以看出病毒在感染CIK細(xì)胞0～12 h期間，病毒RNA水平很低，上升不明顯，病毒滴度處于較低水平，上升趨勢也不明顯；12～24 h期間，病毒RNA和病毒滴度開始明顯上升；24～72 h期間，病毒RNA急劇上升，而病毒滴度在24～48 h期間明顯上升，48 h后趨于平穩(wěn)，72 h時(shí)病毒滴度達(dá)到最高，為106.75TCID50/mL。GCRV 873株感染CIK后12 h時(shí)出現(xiàn)少量細(xì)胞聚集；24 h時(shí)，細(xì)胞聚集增多，出現(xiàn)空斑現(xiàn)象；36 h時(shí)，空斑變大；48 h時(shí)，細(xì)胞大量脫落；72 h時(shí)，細(xì)胞基本已脫落，只有零星細(xì)胞附著于板上（圖5）。
圖2 GCRV重組質(zhì)粒熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)
圖3 GCRV熒光定量PCR特異性檢測的擴(kuò)增反應(yīng)
2.3 GCRV 873株在草魚體內(nèi)的復(fù)制情況
GCRV 873株感染草魚后，其肝、脾、腎中的病毒RNA拷貝數(shù)變化如圖6所示。3個(gè)組織中的病毒RNA均呈先升后降趨勢，其中肝臟中的病毒RNA峰值位于感染后3 d，脾臟和腎臟峰值位于感染后2 d。3種組織中，病毒RNA峰值最高的為腎臟，肝臟次之，脾臟最低；肝臟、腎臟和脾臟中的病毒RNA分別在至感染后7、6、4 d時(shí)下降到趨近于零的水平。
圖4 GCRV 873株感染CIK細(xì)胞后病毒滴度與RNA復(fù)制水平變化規(guī)律 圖5 GCRV 873株感染CIK細(xì)胞后細(xì)胞病變情況
3討論
本研究從病毒RNA拷貝數(shù)、子代病毒含量及細(xì)胞病變3個(gè)方面綜合分析GCRV在CIK細(xì)胞中的增殖過程。試驗(yàn)結(jié)果表明，GCRV在感染CIK細(xì)胞的早期病毒RNA拷貝數(shù)及病毒滴度均處于較低水平，說明這一時(shí)期的病毒多為殘余的原代病毒及最先釋放出來的子代病毒；24～72 h期間，病毒RNA水平迅速上調(diào)，呈現(xiàn)對數(shù)增長，而病毒滴度在24～48 h期間呈明顯上升，之后趨于平穩(wěn)；對照48 h的細(xì)胞CPE發(fā)展完全，說明細(xì)胞被完全裂解，胞內(nèi)病毒得以釋放，使病毒滴度趨于平穩(wěn)。曾令兵等利用組織培養(yǎng)微量滴定系統(tǒng)，研究GCRV-854毒株在CIK細(xì)胞上的繁殖過程，其動(dòng)態(tài)曲線與本研究相似，但出現(xiàn)快速增殖的時(shí)間較本研究晚，說明不同毒株感染細(xì)胞的能力存在差異。鄒桂平等在電鏡下觀察到GCRV在感染CIK細(xì)胞4 h以內(nèi)出現(xiàn)脫去部分外層衣殼的不完整病毒顆粒，感染8 h時(shí)漿胞內(nèi)出現(xiàn)大量亞病毒顆粒，無外層蛋白結(jié)構(gòu)，感染12～16 h后出現(xiàn)成熟的病毒粒子。丁清泉等發(fā)現(xiàn)GCRV在感染細(xì)胞12 h后即開始增殖，24～72 h大量增殖，使細(xì)胞產(chǎn)生典型的細(xì)胞病變效應(yīng)，5 d左右達(dá)到最大增殖，此時(shí)病毒的滴度最高，以后逐漸平緩。分析病毒在細(xì)胞中的增殖過程，不僅反映出病毒的生長特性，還指示出收獲細(xì)胞培養(yǎng)的病毒材料的最佳時(shí)間。
應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)，實(shí)時(shí)監(jiān)測GCRV在草魚體內(nèi)的病毒拷貝數(shù)，為精確分析病毒在魚體中的增殖過程提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本試驗(yàn)采用的毒株GCRV 873株為1型。該毒株在體外細(xì)胞中培養(yǎng)可使細(xì)胞產(chǎn)生明顯病變，但是草魚感染后未出現(xiàn)發(fā)病死亡情況，而其肝、脾、腎中的病毒RNA水平出現(xiàn)短期上升后下降到對照水平的結(jié)果，也正與無發(fā)病死亡情況相符。殷亮研究發(fā)現(xiàn)GCRV HZ08株在感染稀有鮈鯽后，脾臟和腎臟中的病毒RNA水平呈現(xiàn)先升后降趨勢，與本研究結(jié)果一致。丁清泉等發(fā)現(xiàn)經(jīng)人工感染GCRV的魚體腎臟組織細(xì)胞內(nèi)，存在無外衣殼的未成熟病毒。毛樹堅(jiān)等觀察草魚出血病的病理切片發(fā)現(xiàn)在肝臟、肌肉、腎臟、脾臟、鰓等魚體組織中含有大量的病毒顆粒。在本研究對比3種組織中病毒RNA的含量，發(fā)現(xiàn)腎臟中的含量最高，提示在取樣檢測時(shí)，可優(yōu)先考慮腎臟組織。
圖6 GCRV 873株感染草魚后不同組織中病毒RNA復(fù)制水平的變化規(guī)律
4結(jié)論
本研究顯示：GCRV在感染CIK細(xì)胞12 h后病毒RNA和病毒滴度開始上升；24～72 h期間，病毒RNA急劇上升，病毒滴度則在24～48 h內(nèi)明顯上升，48 h后趨于平穩(wěn)，至72 h，病毒滴度達(dá)到最高，為106.75TCID50/mL。在感染CIK后36 h，所有細(xì)胞均已感染，72 h時(shí)，細(xì)胞基本上脫落。GCRV感染草魚后，均能在其肝、脾、腎中檢測到病毒，且病毒RNA均呈先升后降趨勢；腎臟中的病毒RNA含量最高，因此應(yīng)優(yōu)先采集腎臟組織進(jìn)行檢測。
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