草魚呼腸孤病毒培養(yǎng)與滴度測(cè)定、及在草魚、CIK細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性研究（一）
草魚（Ctenopharyngodon idella）是我國(guó)的主要淡水養(yǎng)殖品種。然而各種疾病的暴發(fā)嚴(yán)重阻礙了草魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，如出血性疾病、細(xì)菌性腸炎和細(xì)菌性敗血癥，給草魚養(yǎng)殖戶造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）是我國(guó)第1株分離鑒定的魚類病毒，也是水生呼腸孤病毒屬中致病力最強(qiáng)的毒株。由其引起的草魚出血病是草魚養(yǎng)殖過程中的最大病害，死亡率高達(dá)60%以上，嚴(yán)重影響了草魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。因其危害性大、流行范圍廣、發(fā)病季節(jié)長(zhǎng)，使該病一直為我國(guó)魚類病毒病的研究重點(diǎn)。學(xué)者們就該病毒的流行病學(xué)、生物化學(xué)及分子生物學(xué)等進(jìn)行了研究。然而國(guó)際上對(duì)GCRV的研究與哺乳動(dòng)物及禽呼腸孤病毒相比還有很大差距。研究病毒在體內(nèi)的復(fù)制增殖規(guī)律可進(jìn)一步揭示GCRV分子致病機(jī)理，從而為該病防治奠定基礎(chǔ)。目前對(duì)于該病尚無(wú)有效治療方法，主要依靠疫苗預(yù)防。我國(guó)從20世紀(jì)70年代開始研究草魚出血病疫苗，研制出的組織疫苗和細(xì)胞疫苗在生產(chǎn)上收到了較好效果。目前在疫苗生產(chǎn)過程中多使用細(xì)胞來(lái)增殖病毒。GCRV在細(xì)胞上繁殖速度較快，一般培養(yǎng)2～3 d即可觀察到細(xì)胞病變（Cytopathological effect，CPE）。當(dāng)前多使用CIK細(xì)胞來(lái)制備細(xì)胞疫苗，在病毒培養(yǎng)過程中多通過觀察細(xì)胞病變來(lái)收獲病毒。但這種方式并不能準(zhǔn)確反映病毒在細(xì)胞中的增殖規(guī)律，往往錯(cuò)過最佳收獲病毒時(shí)期，致使疫苗免疫效果不理想而造成經(jīng)濟(jì)損失。
Real-time PCR技術(shù)具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果直觀、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠精確分析病毒在細(xì)胞中的增殖規(guī)律，從而為生產(chǎn)細(xì)胞苗提供依據(jù)。為此，本研究利用建立的Real-time PCR方法，對(duì)GCRV在CIK細(xì)胞及草魚體內(nèi)的增殖復(fù)制進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，從而為GCRV致病機(jī)理研究和細(xì)胞滅活疫苗制備奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1試劑材料
M199培養(yǎng)基、胰酶：Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清：購(gòu)自四季青公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs、T載體：購(gòu)自TAKARA公司；Trizol Reagent：購(gòu)于Invitrogen公司；DNA Marker：購(gòu)自鼎國(guó)生物公司；SYBR Green熒光染料：購(gòu)自TOYOBO公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒：購(gòu)自愛思進(jìn)公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.2細(xì)胞、毒株及試驗(yàn)魚
草魚腎細(xì)胞系CIK、GCRV873由本實(shí)驗(yàn)室保存。用于本研究的草魚購(gòu)自浙江省淡水水產(chǎn)研究所苗種基地，體重為10～15 g，分別置于4個(gè)體積約300 L自動(dòng)充氣水循環(huán)系統(tǒng)圓柱形水缸中飼養(yǎng)，每缸放40尾，飼養(yǎng)2周，水溫保持（26±1）℃；試驗(yàn)期間每天投喂顆粒性餌料2次，投餌之前先吸污換水。
1.3 Real-time PCR檢測(cè)方法的建立
1.3.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中GCRV 873毒株VP6蛋白編碼基因序列，應(yīng)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)特異性熒光定量引物VP6-U及VP6-L，同時(shí)針對(duì)草魚內(nèi)參基因β-actin序列設(shè)計(jì)特異性引物。引物序列（表1）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
表1 GCRV熒光定量PCR引物序列
1.3.2標(biāo)準(zhǔn)品制備收集GCRV 873毒株CIK細(xì)胞培養(yǎng)物，按照Trizol說(shuō)明書抽提RNA；用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，分別用引物VP6-U/VP6-L和β-actin-U/β-actin-L擴(kuò)增病毒VP6基因及內(nèi)參基因β-actin。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸20 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，克隆于pMD-18T載體，并將陽(yáng)性克隆送南京金斯瑞公司測(cè)序確認(rèn)。對(duì)測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆抽提質(zhì)粒，測(cè)定濃度，按公式計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)：拷貝數(shù)=（質(zhì)量/分子量）×6.02×1023。
相關(guān)新聞推薦
1、雙歧桿菌分離鑒定、耐受性試驗(yàn)、益生特性試驗(yàn)及安全性評(píng)價(jià)（一）
2、?酵母菌生長(zhǎng)周期及生長(zhǎng)曲線測(cè)定操作步驟
3、基于體外重組雞傳染性貧血病毒生長(zhǎng)曲線研究復(fù)制效率（一）