基于刃天青微量板法檢測沙門氏菌抗生素的耐藥性（一）
摘要采用刃天青微量板法檢測多株沙門氏菌對抗生素的耐藥性，得到最小抑菌濃度（MIC）。通過肉眼觀察和熒光檢測都可判定沙門氏菌的耐藥性，判定時間僅需5 h，刃天青法與微量肉湯稀釋法檢測得到的耐藥性結(jié)果一致。其中用顏色觀察能更清晰明確地分辨出耐藥折點，熒光檢測可以動態(tài)地反映細(xì)菌隨時間變化的生長情況。刃天青微量板法具有簡便、快速、靈敏度高的特點，能確定抗生素的耐藥性和精確耐藥MIC值。
沙門氏菌（Salmonella）作為一種食源性病原體，對人類健康構(gòu)成了巨大威脅。沙門氏菌可通過受污染的畜禽產(chǎn)品、蛋、奶乃至海洋產(chǎn)品感染人類。近年來，由于抗生素的廣泛使用，出現(xiàn)了沙門氏菌耐藥株和多重耐藥株，導(dǎo)致沙門氏菌耐藥性問題日益嚴(yán)重，對畜牧業(yè)和人類健康都構(gòu)成了潛在威脅。
為了應(yīng)對這種威脅，迫切需要進(jìn)行抗生素敏感測試（AST），以快速診斷這些危險細(xì)菌的耐藥性，確保快速、準(zhǔn)確地使用抗生素。當(dāng)前，各種傳統(tǒng)實驗室方法可用來表征微生物對抗生素的體外敏感性，如常量肉湯稀釋和微量肉湯稀釋法、圓盤擴(kuò)散法和抗菌梯度法等。但是，這些方法多數(shù)都需要冗長的測試程序，通常需要經(jīng)歷收集樣品、富集培養(yǎng)物，在這之后還至少需要孵育16 h才能進(jìn)行檢測。耐藥細(xì)菌的流行率增加表明現(xiàn)在迫切需要能夠在數(shù)小時而不是數(shù)天之內(nèi)提供藥敏性數(shù)據(jù)的AST。除了常規(guī)檢測方法，mPCR法和全自動微生物分析儀測定法等新型檢測技術(shù)也已運(yùn)用在耐藥性檢測中。基于已知和賦予細(xì)菌抗性基因的擴(kuò)增和檢測技術(shù)，與常規(guī)培養(yǎng)方法相比，酶促擴(kuò)增技術(shù)減少了檢測時間。但這些技術(shù)需要大型且昂貴的儀器，這限制了它們在資源受限的環(huán)境中的使用。
刃天青（resazurin）作為一種氧化還原染料，活細(xì)菌可以將刃天青轉(zhuǎn)化為粉紅色的熒光染料試鹵靈（resorufin），繼續(xù)反應(yīng)可以變?yōu)榘咨珶o熒光的二氫試鹵靈（dihydroresorufin）。因其安全無毒、經(jīng)濟(jì)實惠的優(yōu)點，已被越來越多地應(yīng)用于細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖能力的評估。以刃天青為指示劑的低成本藥敏試驗方法，能動態(tài)地反映細(xì)菌的生長情況，可以檢測藥物的作用時間和細(xì)菌的耐藥情況。該研究采用刃天青法檢測沙門氏菌對幾種抗生素的敏感性，確定最佳試驗條件，為沙門氏菌的快速、簡便檢測提供一種新方法。
1材料與方法
1.1試材
氧氟沙星（Ofloxacin）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin）購自上海麥克林生化科技有限公司;氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O）購自美國Sigma試劑有限公司;氨芐西林（Ampicillin）、美羅培南（Meropenem）、四環(huán)素（Tetracycline）、刃天青（Resazurin）、鹽酸（HCl）購自上海國藥集團(tuán);營養(yǎng)肉湯（NB）、營養(yǎng)瓊脂（NA）購自上海博威生物醫(yī)藥有限公司。所有溶液均用超純水制備，所有試劑均為分析純。鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028（Salmonella typhimurium）為實驗室保存菌株，其余沙門氏菌（Salmonella）分離株均來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，-80℃保存?zhèn)溆谩?
1.2儀器
Lab Dancer漩渦儀，IKA公司;Spectra MAX M5酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices;WGZ-XT細(xì)菌濁度儀，杭州齊威儀器有限公司;平底96孔細(xì)菌培養(yǎng)板， 丹麥Biosense公司;VB-40立式高溫高壓滅菌鍋，德國SYSTEC;BSC-1300超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;SHP-150生化培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司;EX-OHOUS電子天平，美國奧豪斯公司;Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司。
1.3細(xì)菌培養(yǎng)
取沙門氏菌接種于NB培養(yǎng)基，在37℃搖床培養(yǎng)，通過細(xì)菌濁度儀檢測細(xì)菌濃度。將濃度為0.5 MCF的菌液進(jìn)行梯度稀釋，取100μL涂布NA瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計數(shù)，計算出0.5 MCF菌液對應(yīng)的細(xì)菌培養(yǎng)物的菌落數(shù)及菌落形成單位（CFU/mL）。最后用NB將菌液稀釋成所需濃度，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?
1.4微量肉湯稀釋法藥敏試驗
按美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）方案，將倍比稀釋的不同濃度的抗生素分別加到無菌的96孔培養(yǎng)板中，1～11孔加入系列稀釋抗生素100μL，第12孔不加抗生素作為陽性生長對照。將培養(yǎng)的沙門氏菌菌懸液稀釋至7.5×106 CFU/mL，向每孔中加100μL，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。此時，1～11孔藥物濃度分別為128.000、64.000、32.000、16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125μg/mL。20 h后，觀察96孔培養(yǎng)板中的液體渾濁情況，判斷沙門氏菌是否生長及其對所試抗生素的敏感性。
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